荧光 “导航仪” 精准切除胶质母细胞瘤，小鼠模型验证生存期延长 25%

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Fluorescence-Guided Resection of GL261 Red-FLuc and TRP-mCherry-FLuc Mouse Glioblastoma Tumors

中文标题：5 - 氨基酮戊酸荧光引导切除 GL261 Red-FLuc 和 TRP-mCherry-FLuc 小鼠胶质母细胞瘤的研究

发表期刊：《Cancers》

影响因子：4.4

作者单位：

1. Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Kentucky, Lexington, KY 40536, USA

2. Sanders-Brown Center on Aging, University of Kentucky, Lexington, KY 40536, USA

3. Department of Pharmacology and Nutritional Sciences, College of Medicine, University of Kentucky, Lexington, KY 40536, USA

作者信息：

Louis T. Rodgers, Bryan J. Maloney, Anika M. S. Hartz, Björn Bauer

研究背景

胶质母细胞瘤(GBM)是成人最具侵袭性的脑肿瘤，尽管标准治疗包括手术切除，但患者中位生存期仅 8 个月。当前预临床模型常缺乏手术干预环节，难以模拟临床场景。5 - 氨基酮戊酸(5-ALA)荧光引导手术可增强肿瘤切除精度，但在动物模型中的应用仍局限。本研究通过构建两种 GBM 小鼠模型，验证 5-ALA 引导切除的疗效，为临床转化提供关键依据。

研究方法

研究通过 CRISPR 技术构建 GL261 Red-FLuc 和 TRP-mCherry-FLuc 细胞系，经立体定位在小鼠颅内 4mm 深度植入肿瘤细胞，术前 2 小时注射 5-ALA(500 mg/kg)，通过荧光显微镜引导切除肿瘤，采用硬脑膜替代物闭合颅骨维持颅内压。利用生物发光成像、MRI 监测肿瘤生长，结合生存分析和混合线性模型评估手术效果，体外实验验证 5-ALA 诱导的荧光积累与细胞密度的相关性。

实验结果

图1：5 - 氨基酮戊酸(5-ALA)的代谢路径示意图

图示展示 5-ALA 通过肽转运蛋白 PEPT1/2 进入细胞，经 ALA 脱水酶、卟胆原脱氨酶等酶促反应，最终转化为原卟啉 IX(PpIX)。PpIX 在 400nm 激发光下发射 630-710nm 荧光，其选择性积累于肿瘤细胞的机制与癌细胞中血红素合成酶表达差异、血管屏障渗漏特性相关。该代谢路径为 5-ALA 在荧光引导手术中的应用提供了理论基础。

图2：手术场景设置

手术操作台布局显示，实验采用 Zeiss 荧光显微镜搭配 Chroma 滤镜组(AT425/50x, AT485DC, AT655/30m)，配合 CoolLED 光源实现 5-ALA 荧光实时监测。操作区还包括立体定位框架、真空吸引装置及无菌器械，确保手术过程中肿瘤组织的精准切除与止血，模拟临床手术的标准化流程。

图3：颅内肿瘤切除流程

手术流程示意图显示，术前 2 小时注射 5-ALA(500mg/kg)，通过颅骨开窗暴露肿瘤后，使用 2mm 直径取样器切除肿瘤组织，再通过荧光显微镜确认残留肿瘤并吸引清除。创口采用硬脑膜替代物(Neuro-Patch®)和骨蜡闭合，维持颅内压稳定，避免传统开放模型的生理干扰。

图4：体外 5-ALA 诱导荧光实验

GL261 Red-FLuc 和 TRP-mCF 细胞在 1mM 5-ALA 处理后，荧光强度随时间显著增加(GL261 组每分钟 RFU 增幅达 0.935)，且 25,000 细胞 / 孔的荧光信号明显强于 12,500 细胞 / 孔。该结果验证了肿瘤细胞对 5-ALA 的代谢活性与细胞密度的正相关性，为体内实验提供了体外依据。

图5：TRP-mCF 肿瘤切除的生存与体重影响

生存曲线显示，TRP-mCF 肿瘤切除组中位生存期为 34 天，较对照组(27 天)和假手术组(26 天)显著延长(p<0.001)。体重变化表明，切除组术后短期体重下降后逐步恢复，而对照组持续下降，提示手术可缓解肿瘤导致的机体代谢异常。

图6：GL261 Red-FLuc 肿瘤切除的综合评估

切除组中位生存期达 32 天(对照组 27 天，p<0.001)，术后肿瘤生物发光信号减少 91.6%，且复发速度显著慢于对照组。尽管切除范围与生存无显著关联(多数小鼠切除率> 95%)，但该模型证实 5-ALA 引导切除可有效抑制肿瘤进展，为临床手术提供了预实验验证。

研究结论

5-ALA 荧光引导切除显著延长两种模型小鼠生存期(TRP-mCF 组 34 天 vs 对照组 27 天，GL261 组 32 天 vs 27 天，p<0.001)，减缓体重下降并抑制肿瘤复发，平均切除率达 91.6%。虽切除范围与生存无显著关联(多数小鼠切除率> 95%)，但该模型成功模拟临床手术场景，为评估术后辅助治疗提供了具转化价值的平台。