近红外光触发的纳米粒子破坏细胞膜，用于癌症成像和光免疫治疗

基本信息

英文标题：Nanoparticles destabilizing the cell membranes triggered by NIR light for cancer imaging and photo-immunotherapy

中文标题：近红外光触发的纳米粒子破坏细胞膜，用于癌症成像和光免疫治疗

发表期刊：《Nature Communications》

影响因子：14.7

作者单位：北京分子科学国家实验室、中国科学院化学研究所、中国科学院大学

作者信息：

Dongsheng Tang, Minhui Cui, Bin Wang, Ganghao Liang, Hanchen Zhang, Haihua Xiao

研究背景

癌症治疗的现状与挑战

化疗和分子靶向治疗是当前主要的临床癌症治疗手段，但存在毒性大、疗效不佳和耐药性等问题。

聚合物-药物偶联物和基于聚合物的药物递送系统成为研究热点，但阳离子聚合物对正常细胞的毒性限制了其应用。

光动力疗法(PDT)的优势与局限

PDT通过光激发敏化剂产生活性氧(ROS)杀死肿瘤细胞，但单独使用PDT诱导的免疫原性细胞死亡(ICD)效果不足。

阳离子聚合物可作为佐剂，通过破坏内体/溶酶体膜增强免疫反应。

研究创新点

设计了一种近红外光(NIR-II)激活的纳米颗粒(mt-NPBodipy)，结合光动力治疗和免疫治疗，实现时空可控的肿瘤靶向治疗

研究方法

纳米颗粒设计与合成

Aza-TPA-Bodipy：NIR-II荧光分子，具有高效ROS生成能力(量子产率16.4%)。

PBodipy：含ROS响应性硫缩酮键的聚合物，用于光控释放。

Pmt：膜靶向阳离子聚合物，含胆固醇分子，用于破坏细胞膜。

mt-NPBodipy：通过自组装形成，具有肿瘤靶向性和光控释放特性。

体外实验

细胞摄取与膜破坏：通过共聚焦显微镜观察纳米颗粒在细胞膜上的定位及膜破坏效果。

细胞毒性：MTT实验评估纳米颗粒对CT26细胞的杀伤效果。

RNA测序分析：研究mt-NPBodipy对细胞转录组的影响。

体内实验

生物分布与成像：通过NIR-II荧光成像评估纳米颗粒在肿瘤中的富集情况。

抗肿瘤效果：在CT26荷瘤小鼠模型中评估肿瘤抑制率、免疫细胞浸润及免疫记忆效应。

实验结果

图1：纳米粒子在近红外光作用下导致细胞膜不稳定性的示意图

PBodipy含有NIR-II荧光Bodipy单元和ROS响应的硫代酮键，这些单元能被近红外光激发产生ROS，进而导致硫代酮键断裂和聚合物降解。Pmt含有大量胆固醇以靶向细胞膜，并含有季铵盐以破坏细胞膜。Pmt自组装形成NPmt，随后被PBodipy屏蔽成mt-NPBodipy。当用808纳米激光激发时，mt-NPBodipy解离，释放出阳离子聚合物Pmt。通过静电相互作用，Pmt能够靶向并插入细胞膜(i，ii)，进而破坏并裂解细胞膜(iii，iv)，最终导致肿瘤细胞死亡。源数据见源数据文件。

图2：Aza-TPA-Bodipy的合成与表征

图(a) Aza-TPA-Bodipy的合成路线。试剂和条件：i)醋酸，吡啶，甲苯，80°C，24小时。ii)亚硝酸甲酯，三乙胺，乙醇，95°C，48小时。iii)醋酸铵，正丁醇，120°C，24小时;BF3OEt2，二异丙基乙胺，二氯甲烷，25°C，24小时。iv)二(3-丁基)钯(III)，P(t-Bu)3，碳酸叔丁酯，甲苯，85°C，24小时。v)氢氟酰吡啶，二氯甲烷，室温，2小时。

图(b) Aza-TPA-Bodipy在四氢呋喃中的吸收光谱和光致发光光谱。

图(c)通过DFT计算优化了Aza-TPA-Bodipy的几何结构和HOMO-LUMO分布。

图(d)通过垂直激发优化结构(见图c)计算出S1-S6和T1-T6的能量水平。

图(e) ln(A0/A)与光照时间的关系图，其中A0和A分别表示辐照前后的DPBF吸光度(415 nm)。源数据文件中提供了源数据。

图3：mt-NPBodipy的制备与表征

图(a)PBodipy的合成路线。试剂和条件：干燥DMF，室温，48小时;mPEG5000OH，室温，24小时。

图(b)Pmt的合成路线。试剂和条件：干燥DMF，室温，48小时;mPEG5000OH，室温，24小时。DMF/CH3CN，N，N-二甲基胆碱，80°C，24小时。

图(c) mt-NPBodipy的代表性TEM图像(n = 3次独立实验)。

图(d) mt-NPBodipy的水动力直径和PDI(n=3次独立实验)。

图(e) mt-NPBodipy的ζ电位(n = 3次独立实验)。

图(f) mt-NPBodipy的吸收光谱。

图(g) mt-NPBodipy的PL光谱。

图(h) mt-NPBodipy在近红外光照射下，以TEMP为陷阱的ESR光谱。

图(i)近红外光照射后mt-NPBodipy的水动力直径变化。

图(j)近红外光照射10分钟后mt-NPBodipy的代表性TEM图像(n = 3次独立实验)。数据以平均值±标准差的形式呈现。源数据文件见源数据文件。

图4：体外评估mt-NPBodipy

图(a) mt-NPBodipy + L的机制示意图。

图(b) CT26细胞与mt-NPBodipy@Cy5.5共孵育后的CLSM图像。叠加图像显示了mt-NPBodipy@Cy5.5在细胞内的定位。DiO(绿色)用于染色细胞膜。mt-NPBodipy@Cy5.5与DiO的共定位以黄色表示。比例尺为10微米。

图(c)通过FCM测定法，图(d)量化CT26细胞与mt-NPBodipy@Cy5.5共孵育后的结果(n = 3次实验重复)。数据通过单因素方差分析(ANOVA)并进行Bonferroni多重比较后检验。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

图(e) CT26细胞经mt-NPBodipy + L处理后的药物反应曲线(n = 4次实验重复)。

图(f) CT26细胞的3D肿瘤球体经PBS、NPBodipy、mt-NPBodipy、NPBodipy + L和mt-NPBodipy+L(10μg/mL−1)处理12小时后的CLSM图像。比例尺为100微米。

图(g) CT26细胞经PBS、NPBodipy、mt-NPBodipy、NPBodipy + L和mt-NPBodipy+L(10μg/mL−1)处理12小时后的SEM图像。比例尺为10微米。对于(b，f，g)，实验独立重复三次，结果相似。

对于图(d)和图(e)，数据以平均值±标准差的形式呈现。源数据文件作为源数据文件提供。

图5：CT26细胞经mt-NPBodipy + L处理后的转录组分析

图(a) CT26细胞经PBS、mt-NPBodipy和mt-NPBodipy + L处理后表达基因的主成分分析(PCA)得分图。

图(b)已识别差异表达基因的维恩图。

图(c)与PBS相比，火山图显示了8521个差异表达基因(总基因数为16592个)，其中4416个基因上调，4105个基因下调。

图(d-f)经mt-NPBodipy + L处理后，细胞中细胞组分(d)、生物过程(e)和分子功能(f)的GO分类。

图(g)经mt-NPBodipy + L处理后差异表达基因的KEGG富集分析。

图(h)GSEA显示mt-NPBodipy + L处理细胞中改变的基因正向富集(数据通过GSEA软件包分析，未作任何修改)。

图6：在携带CT26肿瘤的BALB/c小鼠模型中，评估了mt-NPBodipy + L的成像和光免疫治疗特性

图(a)在CT26肿瘤携带的BALB/c小鼠模型中，使用mt-NPBodipy + L治疗的时间表图。图由Biorender.com创建。

图(b)小鼠在不同时间点注射mt-NPBodipy后，体内NIR-II荧光生物成像。

图(c)小鼠在24小时后被处死后，主要组织和器官(脾脏S;心脏H;肺Lu;肾脏Ki;肝脏L;肿瘤T)的NIR-II荧光成像。

图(d)不同时间点肿瘤部位的半定量NIR-II荧光分析。

图(e) 24小时后器官的半定量NIR-II荧光分析(脾脏S;心脏H;肺Lu;肾脏Ki;肝脏L;肿瘤T)。f肿瘤生长抑制曲线的比较。

图(g)动物模型体重变化的监测。

图(h)在肿瘤组织中，通过CD11c+细胞门控的CD80+ CD86+树突状细胞的流式细胞术图。

图(i)(h)的量化结果。

图(j)淋巴结中，通过CD11c+细胞门控的CD80+ CD86+树突状细胞的流式细胞术图。

图(k)(j)的量化。

图(l)在肿瘤组织中，对CD3+细胞进行CD8+门控的流式细胞术图。

图(m)(l)的量化。

图(n)在肿瘤组织中，对F4/80+细胞进行CD206+门控的M2巨噬细胞的流式细胞术图。

图(o)(n)的量化。数据以均值±标准差表示。每组有5只生物学独立的小鼠。数据通过单因素方差分析(ANOVA)和Bonferroni多重比较后检验(i，k，m，o)以及双因素方差分析(ANOVA)和Bonferroni多重比较后检验(f)进行分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。源数据文件见源数据文件。

图7：mt-NPBodipy + L消除远处肿瘤并诱导长期免疫记忆效应

图(a)在BALB/c小鼠携带CT26肿瘤模型中，mt-NPBodipy+L的治疗方案用于消除远处肿瘤。图由Biorender.com制作。

图(b)对原发肿瘤(n = 7)的生长抑制曲线进行比较。

图(c)对远处肿瘤(n = 7)的生长抑制曲线进行比较。

图(d)通过流式细胞术(FCM)分析，门控在淋巴结中的CD11c+细胞上的CD80+ CD86+树突状细胞。

图(e)对d的量化结果。f通过流式细胞术(FCM)分析，门控在远处肿瘤中的CD3+细胞上的CD8+。g对f的量化结果。

图(h)在BALB/c小鼠携带CT26肿瘤模型中，mt-NPBodipy + L的治疗方案用于诱导长期免疫记忆效应。图由Biorender.com制作。

图(i)治疗小鼠的平均肿瘤生长曲线(n = 5)。

图(j)治疗小鼠的生存曲线(n = 5)。

图(k)从淋巴结中的CD8+ T细胞中相对定量效应记忆T细胞(Tem，CD62L+ CD44+)亚群。

图(l)从淋巴结中的CD8+ T细胞中相对定量中心记忆T细胞(Tcm，CD62L+ CD44+)亚群。

图(m，n)肿瘤再挑战后血清中TNF-α (m)和IFN-γ (n)的细胞因子水平。数据以均值±标准差表示(e，g，k-n)。每组n = 5只生物学独立的小鼠(e，g，k-n)。数据通过双因素方差分析结合Bonferroni多重比较后检验(b，c，和i)，Log-rank(Mantel-Cox)检验(j)，以及双尾非配对t检验(e，g，k-n)进行分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。源数据见源数据文件。

研究结论

创新策略：

通过NIR-II光控纳米颗粒实现细胞膜破坏、光动力治疗和免疫治疗的协同作用。

阳离子聚合物Pmt 直接破坏肿瘤细胞膜，克服了传统PDT免疫激活不足的局限。

转化意义：

为实体瘤治疗提供了一种高效、低毒的多模式联合治疗方案。

通过光控释放实现精准治疗，减少对正常组织的损伤。