科学家发现乙肝病毒入侵 “帮凶”！这种蛋白让肝细胞易感性提升 50%

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：Neuropilin-1 is a novel host factor modulating the entry of hepatitis B virus

中文标题：神经纤毛蛋白 - 1 是调控乙型肝炎病毒入侵的新型宿主因子

发表期刊：《Journal of Hepatology》

影响因子：33

作者单位：

1. Department of Infectious Diseases, Key Laboratory of Molecular Biology for Infectious Diseases (Ministry of Education), Institute for Viral Hepatitis, The Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing, China

2. College of Biomedical Engineering, Chongqing Medical University, Chongqing, China

3. Basic Medicine Research and Innovation Center for Novel Target and Therapeutic Intervention (Ministry of Education), Institute of Life Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing, China

作者信息：

Haibo Yu, Jihua Ren, Haijun Deng, Linfeng Li

研究背景

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球重大公共卫生问题，全球约 2.57 亿慢性携带者，每年导致约 88.7 万人死亡，且现有疗法因无法清除宿主细胞核内的共价闭合环状 DNA(cccDNA)需终身治疗。钠 - 牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)虽为 HBV 的细胞受体，但其表达水平无法完全解释肝细胞对 HBV 感染的易感性差异，提示存在其他宿主因子参与调控感染过程。神经纤毛蛋白 - 1(NRP1)作为跨膜糖蛋白，已被证实是多种病毒的细胞(共)受体，但其在 HBV 感染中的作用尚未明确。

研究方法

研究对 5 例未接受抗病毒治疗的 HBV 感染儿童肝活检样本进行单细胞 RNA 测序，分析肝细胞异质性及基因表达差异;利用 HepG2-NTCP 细胞、原代人肝细胞(PHHs)，通过慢病毒介导的过表达或 CRISPR/Cas9 敲低 NRP1，结合 HBV 感染模型评估其对病毒附着、内吞及复制的影响;构建人肝嵌合小鼠模型，通过腹腔注射 NRP1 拮抗剂 EG00229，验证其体内抗 HBV 效果;采用免疫共沉淀、微尺度热泳(MST)及基因突变实验，解析 NRP1 与 HBV 大表面蛋白(LHBs)及 NTCP 的相互作用机制。

实验结果

图1：儿童 HBV 感染肝组织的单细胞转录组图谱

通过单细胞 RNA 测序分析 5 例 HBV 感染儿童肝活检样本，鉴定出 16 个细胞群，其中肝细胞分为 3 个亚群(C1-C3)。C1 亚群 HBV 转录水平和 NTCP 表达最高，而 C2 亚群 NTCP 水平低但 HBV 转录水平高于 C3，提示存在其他因子调控感染效率。

图2：NRP1 作为 HBV 感染重要宿主因子的鉴定

对比 C2 和 C3 肝细胞亚群，发现 368 个上调基因富集于病毒入侵相关通路。PPI 网络分析筛选出 40 个枢纽基因，其中 NRP1 敲低显著抑制 HBV 感染，且在 PHHs 中 NRP1 表达与 HBV 转录水平正相关。

图3：NRP1 在促进 HBV 感染中的重要作用

NRP1 与 NTCP 共表达可增强 HBV 感染，过表达 NRP1 显著促进 HBV 附着和内吞，而敲低 NRP1 则抑制感染。此外，NRP1 对 HDV 感染也有类似促进作用，提示其对依赖 NTCP 的病毒入侵具普适性。

图4：接种前敲低 NRP1 抑制 HBV 感染

接种前敲低 NRP1 可减少细胞内 cccDNA、HBV RNA 及分泌型抗原水平，而接种后敲低无明显作用，证实 NRP1 主要影响 HBV 感染早期阶段。

图5：NRP1 与 HBV LHBs 的相互作用

NRP1 特异性结合 LHBs，而非中、小表面蛋白，其 b 结构域介导与 preS1 的相互作用。突变 NRP1 的 b 结构域或 preS1 的 R88、R92 位点可阻断两者结合。

图6：preS1 中精氨酸残基 88 和 92 对结合 NRP1 至关重要

计算对接和实验验证显示，preS1 的 R88 和 R92 是与 NRP1 结合的关键位点，突变后显著降低两者结合亲和力及 HBV 感染能力。

图7：NRP1 与 preS1 的相互作用调节 NTCP 介导的 HBV 感染

NRP1-preS1 相互作用增强 NTCP 与 preS1 的结合，促进病毒入侵。preS1 突变或 EG00229 处理可削弱该相互作用，抑制 HBV 感染。

图8：NRP1 拮抗剂 EG00229 在 HBV 感染人肝嵌合小鼠模型中的抗病毒活性

EG00229 预处理显著降低人肝嵌合小鼠的血清 HBsAg 水平及肝内 cccDNA、HBV RNA 含量，且无明显毒性，证实其在体内的抗 HBV 效果。

研究结论

NRP1 通过与 LHBs 的 preS1 结构域中精氨酸残基 R88 和 R92 结合，形成 NRP1-preS1-NTCP 复合物，增强 HBV 与 NTCP 的相互作用，促进病毒附着和内吞，其过表达可使 HBV 感染效率提升约 50%。敲低或敲除 NRP1 显著抑制 HBV 感染，而 NRP1 拮抗剂 EG00229 在细胞模型和人肝嵌合小鼠中可阻断 NRP1-preS1 相互作用，抑制 HBV 感染且无明显毒性，为 HBV 治疗提供了新靶点。