海绵状纳米 “快递员”：焦磷酸镁微粒助力抗癌疫苗高效激活免疫细胞

同源异体小鼠肿瘤模型是免疫肿瘤学(I/O)研究中不可或缺的临床前模型，但它们对免疫检查点抑制剂(ICIs)的反应有限，这可能是由于它们的固有低免疫原性。为了解决这一问题，研究人员通过将鸡卵清蛋白(OVA)这一高度免疫原性的蛋白质表达到同源异体肿瘤细胞中，开发了新的免疫原性同源异体模型。这些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，显示出比它们的亲本细胞系更慢的肿瘤生长速度，这可能是由于免疫介导的排斥反应。更重要的是，这些OVA表达的模型对ICIs，特别是抗PD-1治疗，表现出更高的敏感性，这表明它们在增强T细胞介导的免疫反应方面具有潜力。此外，通过过继T细胞转移实验，研究人员验证了这些模型中存在肿瘤特异性记忆T细胞。这些结果表明，OVA工具细胞不仅增强了对ICIs的反应，而且为临床前免疫治疗评估提供了新的、具有更高免疫原性的同源异体模型，这对于I/O研究具有重要的意义。

基本信息

英文标题：Application of Magnesium Pyrophosphate-Based Sponge-Like Microparticles to Enhance the Delivery Efficiency and Adjuvant Effects of Polyriboinosinic-Polyribocytidylic Acid in Immune Cells

中文标题：焦磷酸镁基海绵状微粒在提升聚肌胞苷酸于免疫细胞中的递送效率及佐剂效应的应用

发表期刊：《Journal of Pharmaceutical Sciences》

影响因子：3.8

作者单位：

Department of Biopharmaceutics and Drug Metabolism, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyoto University, Sakyo-ku, Kyoto 606-8501, Japan

作者信息：

Shoichi Takagi, Yuki Takahashi, Kanako Sugimura, Makiya Nishikawa, Yoshinobu Takakura

研究背景

免疫治疗中，TLR 配体(如聚肌胞苷酸 polyI:C)作为佐剂可激活免疫细胞，但需有效递送系统将其导入内体。镁焦磷酸微粒(MgPP)由氯化镁与焦磷酸钠混合制备，具生物相容性与海绵状结构，可能成为核酸类佐剂的理想载体。本研究探索 MgPP 装载 polyI:C(polyI:C-MgPP)对免疫细胞的激活作用及抗原呈递增强效果，为新型疫苗佐剂开发提供思路。

研究方法

研究通过混合 2 mM 焦磷酸钠与 16 mM 氯化镁，于 37℃孵育 20 小时后离心洗涤制备 MgPP，并在制备过程中加入 200 μg/mL polyI:C 制得 polyI:C-MgPP，通过测定 260 nm 吸光度评估装载效率。利用扫描电镜观察微粒形态及 pH 5/7 条件下的降解情况，通过 ELISA 检测 RAW264.7 细胞 TNF-α 释放及 DC2.4 细胞与 CD8OVA1.3 共培养的 IL-2 水平，结合流式细胞术和荧光显微镜验证细胞对 Cy3-polyI:C-MgPP 及 FITC-OVA 的摄取效率，实时 PCR 分析 DC2.4 细胞 CD80/CD86 表达，MTT 法检测细胞活力，数据采用 Tukey 检验统计分析。

实验结果

图1：MgPP 与 polyI:C-MgPP 的 SEM 形态及 pH 依赖性降解

MgPP 与 polyI:C-MgPP 均呈直径约 1 μm 的多孔海绵状球形，pH 5 缓冲液中孵育 1 小时后微粒降解显著，对应 polyI:C 释放率达 90%(pH 5)和 15%(pH 7)，表明酸性环境促进微粒降解及 polyI:C 释放。

图2：RAW264.7 细胞对 polyI:C-MgPP 的摄取效率

流式细胞术与荧光显微镜显示，RAW264.7 细胞对 Cy3-polyI:C-MgPP 的摄取量为游离 polyI:C 的 4 倍，证实 MgPP 载体显著增强 polyI:C 的细胞内吞效率。

图3：polyI:C-MgPP 诱导的 TNF-α 释放及细胞毒性

polyI:C-MgPP 刺激 RAW264.7 细胞释放 TNF-α 量为游离 polyI:C 的 4 倍，氯喹抑制内体酸化后释放量显著降低，表明依赖 TLR3 通路;MTT 实验证实 MgPP 与 polyI:C-MgPP 无细胞毒性，polyI:C-LFN 略降低细胞活力。

图4：DC2.4 细胞对 OVA 的摄取影响

流式细胞术显示，添加 polyI:C-MgPP 不影响 DC2.4 细胞对 FITC-OVA 的摄取，排除因抗原摄取增加导致的呈递效率提升。

图5：polyI:C-MgPP 对 DC2.4 细胞抗原呈递的增强作用

OVA 与 polyI:C-MgPP 共孵育时，DC2.4 细胞诱导 CD8OVA1.3 T 细胞分泌 IL-2 的量显著高于 OVA 单独或与游离 polyI:C 组，证实 polyI:C-MgPP 有效提升抗原呈递能力。

图6：DC2.4 细胞共刺激分子 CD80/CD86 的 mRNA 表达

实时 PCR 显示，polyI:C-MgPP 显著诱导 CD80 mRNA 表达，游离 polyI:C 无此作用，polyI:C-LFN 仅中度诱导，CD86 表达无显著变化，提示 polyI:C-MgPP 通过上调 CD80 促进树突状细胞成熟。

研究结论

MgPP 成功装载 polyI:C(装载效率 55%-70%)，呈直径约 1 μm 的海绵状结构，在酸性条件下(pH 5)释放 90% polyI:C。polyI:C-MgPP 被 RAW264.7 细胞摄取效率较游离 polyI:C 提升 4 倍，显著促进 TNF-α 释放(4 倍于游离组)。在 DC2.4 细胞中，polyI:C-MgPP 协同卵清蛋白(OVA)增强 IL-2 分泌，上调 CD80/CD86 表达，证实其通过促进树突状细胞成熟提升抗原呈递能力。该载体兼具生物相容性与高效佐剂活性，为核酸类免疫佐剂递送提供新策略。