科研新发现查尔酮类化合物竟能 “熄灭” 萤火虫荧光？环结构决定生物发光抑制力

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Chalcones inhibit firefly bioluminescence dependent on A and B-ring substitution pattern – a structure-activity study combined with molecular docking

中文标题：查尔酮类化合物通过 A 环和 B 环取代模式抑制萤火虫生物发光 —— 结合分子对接的构效关系研究

发表期刊：《J Enzyme Inhib Med Chem》

影响因子：5.6

作者单位：

1. Organic-analytical Chemistry, Weihenstephan-Triesdorf University of Applied Sciences, Straubing, Germany

2. TUM Campus Straubing for Biotechnology and Sustainability, Technical University of Munich, Straubing, Germany

作者信息：

Corinna Urmann、Michael Kirchinger、Herbert Riepl

研究背景

查尔酮是药物化学中的优势骨架，其中吡喃查尔酮具有神经再生和神经保护作用。但荧光素酶报告基因实验中，抑制剂可能通过稳定萤火虫荧光素酶(FLuc)产生假阳性结果。本研究发现吡喃查尔酮可抑制 FLuc 活性，抑制率从 0 到 100% 不等，IC₅₀值为 7.82 µM 至 92.99 µM。分子对接显示，化合物结构对 FLuc 抑制的选择性与环取代模式密切相关，微小结构修饰即可显著改变抑制活性，提示报告基因实验中需谨慎解读结果。

研究方法

研究通过多步合成制备了 20 种具有不同 A 环和 B 环取代模式的吡喃查尔酮衍生物，利用核磁共振(NMR)和高分辨质谱(HRMS)表征结构。采用荧光素酶抑制实验，将化合物与 FLuc 孵育后测定发光强度，计算抑制率和 IC₅₀值。结合 AutoDock Vina 进行分子对接，分析化合物与 FLuc 的结合模式，通过 UCSF Chimera 可视化结合能和氨基酸相互作用。

实验结果

图1：Xanthohumol C 与化合物 2 对 FLuc 的抑制率对比

天然产物 Xanthohumol C(1)在 10 µM 时无 FLuc 抑制作用，而简化衍生物化合物 2(缺乏 A 环取代基)抑制率达 30%。结果表明，A 环取代基的缺失显著增强抑制活性，为后续构效关系研究提供起点。

图2：不同 A 环和 B 环取代模式的吡喃查尔酮结构

展示 20 种化合物的化学结构，A 环包括 chromane-like 环、thiochromane 环等，B 环含羟基、甲氧基、氨基、卤素等取代基。结构差异为分析取代模式对抑制活性的影响提供基础。

图3：各化合物在 10 µM 浓度下的 FLuc 抑制率

化合物 2(A 环无取代)抑制率最高(32%)，A 环引入甲氧基(化合物 3)或羟基(化合物 5)抑制率降至 5% 以下;B 环取代基中，羟基(化合物 15、16)和甲基(化合物 11)提升抑制率，而三氟甲基(化合物 13)几乎消除活性。结果证实环取代模式对抑制效果的决定性作用。

图4：FLuc 抑制活性的 IC₅₀值分布

化合物 14(B 环无取代)IC₅₀最低(7.82 µM)，化合物 18(B 环 2,3 - 二羟基)IC₅₀为 9.47 µM，而化合物 7(A 环硫取代)IC₅₀高达 92.99 µM。数据表明，非极性取代基和 B 环邻位羟基可增强抑制活性。

图5：分子对接揭示化合物与 FLuc 的结合模式

化合物 14 通过 B 环与 GLY246、PHE247 形成 π-π 堆积，A 环与 ALA348、ARG337 氢键结合，结合能达 - 10.42 kcal/mol;化合物 18 的 B 环羟基与 THR346、ALA348 形成氢键，结合能 - 10.60 kcal/mol。对接结果解释了实验中高抑制活性的结构基础。

研究结论

吡喃查尔酮对 FLuc 的抑制作用依赖于 A 环和 B 环的取代模式：A 环无取代基或 B 环含羟基、甲基等基团时抑制作用较强，而引入甲氧基、卤素或三氟甲基等电子吸电子基团会减弱抑制效果。分子对接显示，未取代 A 环可深入 FLuc 活性口袋，通过 π-π 堆积和氢键与氨基酸残基(如 ALA348、ARG218)结合，其中化合物 14 和 18 的 IC₅₀低于 10 µM。由于抑制活性浓度与体内外实验常用浓度重叠，使用 FLuc 报告基因 assay 时需警惕假阳性风险。