原位肿瘤细胞工程逆转免疫逃逸以增强免疫治疗效果

基本信息

英文标题：In situ tumor cell engineering reverses immune escape to enhance immunotherapy effect

中文标题：原位肿瘤细胞工程逆转免疫逃逸以增强免疫治疗效果

发表期刊：《Acta Pharmaceutical Sinica B》

影响因子：14.7

作者单位：山东大学药学院、山东省医学科学院

作者信息：

Shujun Liu, Shijun Yuan, Meichen Liu, Jinhu Liu, Shunli Fu, Tong Gao, Shuang Liang, Xinyan Huang, Xinke Zhang, Yongjun Liu, Zipeng Zhang, Na Zhang

研究背景

免疫治疗的现状与瓶颈

免疫治疗(如免疫检查点抑制剂、CAR-T细胞疗法)在肿瘤治疗中取得了突破性进展，但其临床响应率仍存在显著局限性：

实体瘤响应率低：PD-1/PD-L1抑制剂仅对约20%-30%的实体瘤患者有效，而CAR-T疗法在血液肿瘤中效果显著，但在实体瘤中疗效有限。

耐药性问题：部分患者初始响应后出现继发性耐药，导致疾病进展。

肿瘤免疫逃逸的核心机制

免疫治疗失败的主要原因是肿瘤细胞通过多种机制逃避免疫系统的识别和攻击，包括：

(1)抗原呈递缺陷

MHC-I表达下调：肿瘤细胞通过表观遗传修饰或突变降低MHC-I表达，使T细胞无法识别肿瘤抗原。

肿瘤特异性抗原(TSA)缺失：肿瘤细胞可能丢失或减少TSA表达，导致免疫系统无法靶向清除。

(2)免疫抑制性微环境(TIME)的形成

肿瘤细胞通过分泌免疫抑制因子(如TGF-β、IL-10)或招募调节性T细胞(Treg)、髓系来源的抑制细胞(MDSC)等，构建免疫抑制性微环境，阻碍T细胞功能。

B细胞的异质性作用：

传统观点认为B细胞主要发挥免疫抑制作用(如Breg细胞)。

但近年研究发现，ICOSL+ B细胞亚群可增强T细胞抗肿瘤活性，而肿瘤细胞高表达的补体抑制蛋白CD55会抑制ICOSL+ B细胞的生成。

现有策略的局限性

目前针对免疫逃逸的研究主要集中在：

增强T细胞功能(如双靶点CAR-T、免疫检查点抑制剂联用)。

调节免疫微环境(如靶向TAMs、MDSCs)。

然而，这些方法大多聚焦于“下游”免疫细胞调控，而忽略了“上游”肿瘤细胞本身的逃逸机制。

本研究的创新思路

本研究提出“原位肿瘤细胞工程”策略，直接从源头阻断免疫逃逸：

恢复T细胞识别：通过基因递送系统在肿瘤细胞表面强制表达MHC-I/TSA复合物，增强抗原呈递。

逆转免疫抑制微环境：沉默肿瘤细胞CD55，促进ICOSL+ B细胞生成，改善T细胞功能。

协同免疫激活：联合低剂量DOX诱导免疫原性细胞死亡(ICD)，进一步促进DC成熟和T细胞浸润。

研究方法

纳米颗粒制备与表征

LCPN@ACD的构建： 通过薄膜分散法制备负载MAC pDNA和DOX的阳离子脂质体(LNP@ACD)，外层包裹CMCS-PEG-NGR(CPN)形成LCPN@ACD。

表征： 粒径、电位、pH响应性释放(酸性TME中分解为小尺寸LNP@ACD)。

体外实验

细胞摄取与穿透： 验证LCPN@ACD在酸性环境中的肿瘤靶向性和深层穿透能力。

溶酶体逃逸： 通过荧光标记质粒验证纳米颗粒的胞质递送效率。

免疫原性细胞死亡(ICD)： DOX诱导的CRT暴露、HMGB1释放和ATP分泌。

基因表达与沉默

MHC-I/TSA表达： MAC pDNA编码MHC-I和ASMTNMELM(结肠癌TSA肽)，促进肿瘤细胞表面抗原呈递。

CD55沉默： shRNA下调CD55，增加ICOSL+ B细胞比例。

体内实验

肿瘤模型： MC38结肠癌小鼠模型，评估LCPN@ACD单独或联合aPD-1/CAR-T的疗效。

免疫细胞分析： 流式检测DC成熟、CTL浸润、ICOSL+ B细胞比例及细胞因子水平。

实验结果

图1：展示了LCPN@ACD的制备过程及通过肿瘤细胞编辑来提高免疫治疗效果的示意图

(A) LCPN@ACD被制备成核壳纳米颗粒，通过NGR靶向肿瘤组织，并在酸性肿瘤微环境中解体。

(B) 原位肿瘤细胞工程策略通过恢复T细胞识别和缓解免疫抑制的肿瘤微环境，逆转了免疫逃逸。LNP@ACD能够被肿瘤细胞迅速激活，并在溶酶体逃逸过程中释放MAC质粒DNA和DOX。MAC质粒DNA被转录为MCH-I/TSA，位于肿瘤细胞表面，从而促进免疫反应的激活和效应T细胞的识别。MAC质粒DNA还被转录为CD55 shRNA，减少肿瘤细胞的CD55表达，增加ICOSL+B细胞的比例，逆转免疫抑制的微环境。DOX诱导Iscence，促进DC成熟，进一步增强抗肿瘤免疫反应。逆转了肿瘤主导的免疫逃逸，显著增强了aPD-1和CAR-T疗法的免疫治疗效果。此图使用BioRender.com软件创建。

图2：展示了LCPN@ACD成功制备，具有电荷/尺寸双重转换能力

图中显示了LNP@ACD (A)和LCPN@ACD (B)的ζ电位、粒径和形态，比例尺为200纳米。

(C，D) 不同pH值下LCPN@ACD的粒径和ζ电位。

(E) 在48小时内不同pH条件下DOX的累积释放曲线。

(F) 4°C下14天内LCPN@ACD的粒径和ζ电位稳定性。

(F) 不同pH条件下LCPN@D在MC38细胞上的细胞摄取情况，比例尺为100毫米。

(G) 图中还展示了代表性流程图(H)和MC38细胞的荧光强度(I)，数据以平均值标准差的形式呈现。*P < 0.05，**P < 0.01和***P < 0.001。

图3：显示了LCPN@ACD在肿瘤靶向、肿瘤穿透和溶酶体逃逸方面的能力

代表性图像(A)、流程图(B)和量化数据(C)展示了其在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)上的摄取情况，比例尺为200毫米。

小鼠接受IR780含制剂后的荧光图像(D)。静脉注射IR780含制剂后24小时，主要器官的体外成像(E)和总荧光强度(F)。

MC38肿瘤球体与DOX含制剂孵育5小时后的图像(G)，比例尺为200毫米。肿瘤球切片的荧光强度量化结果。

代表性图像和荧光分布显示，AF488-pDNA和溶酶体在MC38细胞中孵育2小时(I和J)和5小时(K和L)后的情况，比例尺为30毫米。溶酶体用红色标记，AF488-pDNA用绿色标记。红色线表示溶酶体的荧光强度，绿色线表示AF488-pDNA的荧光强度。LNP@ACD代表载药内脂质纳米颗粒;LCP@ACD代表CMCS-PEG修饰的LNP@ACD;LCPN@ACD代表CMCS-PEG-NGR修饰的LNP@ACD;LCPN@ACI代表在DOX被IR780替代后得到的LCPN@ACD。数据以均值标准差(n=3)的形式呈现。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

图4：LCPN@ACD上调肿瘤MHC-I/TSA表达，下调肿瘤CD55表达，并诱导ICD效应

体外培养48小时后，MC38细胞与LCPN@ACD孵育的荧光显微镜图像(A)、流程图(B)和荧光强度(C)(n=3)，比例尺为200毫米。

(D)肿瘤切片分析显示EGFP在肿瘤部位的表达(比例尺为50毫米)。

(E)共聚焦显微镜图像显示MC38细胞上的MHC-I/SIINFEKL表达(比例尺为10毫米)。

(F，G)脾脏中OVA特异性T细胞的流式细胞术分析(n=3)，在给予LCPN@OCD后。

(H)体外流式细胞术分析显示与LCPN@ACD孵育后的CD55表达(n=3)。

(I)免疫荧光染色显示给予LCPN@ACD后肿瘤组织中的CD55表达(比例尺为100毫米)。

(J，K)流式细胞术分析显示给予LCPN@OCD后肿瘤组织中的ICOSL+B细胞表达(n=3)。荧光显微镜图像(L)和定量分析(M)显示CRT暴露的肿瘤细胞和HMGB1释放的肿瘤细胞(N和O)，经含DOX的制剂处理后，比例尺为100毫米。ELISA分析显示从MC38细胞释放的ATP (P)。(Q)体外细胞活力分析显示不同制剂处理后的MC38细胞活力(n=3)。LCPN@OCD中的O表达OVA，而LCPN@ACD中的A表达ADPGK。数据以均值标准差表示。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

图5：初步抗肿瘤效果及LCPN@OCD的免疫刺激能力

(A) 给药时间表。

(B) 图5C-I所示抗肿瘤实验的分组。

(C) 不同配方处理的小鼠肿瘤生长曲线(n=6)。

(D) 第14天的肿瘤重量(n=6)

(E) 14天内每两天记录一次体重(n=6)。

(F，G) 肿瘤中成熟树突状细胞的流式细胞术分析(n=3)。

(G，I) 肿瘤中CD4+和CD8+T细胞的流式细胞术分析(n=3)。数据以均值标准差表示。*P < 0.05，**P < 0.01和***P < 0.001。

图6：LCPN@ACD在皮下肿瘤模型和再挑战研究中表现出优异的抗肿瘤效果，并增强了aPD-1的治疗效果

(A) MC38荷瘤小鼠的治疗时间表。

(B) 图6B至E的分组设置。

(C) 14天内的肿瘤生长曲线(n=6)。

(D) 第14天记录的肿瘤重量(n=6)。

(E) 肿瘤切片的H&E、Ki67和TUNEL染色，比例尺为100或200毫米。

(F) 再挑战后肿瘤体积的变化(n=6)。

(G) 再挑战研究后不同组的肿瘤重量(n=6)。

(H，I) 第28天脾脏中CD4+TEM细胞比例的流程图和定量分析(n=3)。

(J，K) 第28天脾脏中CD8+TEM细胞比例的流程图和定量分析(n=3)。图6G-K的分组设置与图6F一致。数据以均值标准差表示。*P < 0.05，**P < 0.01和***P < 0.001。

图7： LCPN@ACD成功逆转了TIME，并进一步增强了免疫反应

(A) 分组。(B，C)对肿瘤中ICOSL阳性B细胞的流式细胞术分析(n=3)。

(D，E) 对肿瘤中成熟DCs的分析(n=3)。

(F，G) 对CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞的流式细胞术分析(n=3)。

(H，I) 对肿瘤浸润CTLs的分析(n=3)。

(J，K) 对肿瘤浸润Treg细胞的分析(n=3)。

(L) CD8阳性T/Treg的定量分析。

(M) TIME中相对细胞因子含量的热图(n=3)。数据以均值标准差表示。*P < 0.05，**P < 0.01和***P < 0.001。

图8： LCPN@CCD能够增强CAR-T细胞对低抗原表达肿瘤的治疗效果

(A) 表示给药时间表的示意图。

(B) 和(C)显示了给药期间小鼠的肿瘤生长曲线和肿瘤重量。

(D) 显示了给药期间小鼠的体重。

(E) 显示了再次挑战后肿瘤体积的变化曲线。

(F) 显示了再次挑战后肿瘤的重量。

(G，H) 显示了再次挑战后脾脏中CD4+TEM细胞的比例。

(I，J) 显示了再次挑战后脾脏中CD8+TEM细胞的比例。数据以均值标准差的形式呈现。*P < 0.05，**P < 0.01和***P < 0.001。图8B包含了图8B至8D的分组设置;图8E包含了图8E至8J的分组设置。

研究结论

创新策略： 原位编辑肿瘤细胞，通过“抗原修复(MHC-I/TSA)+ 微环境逆转(CD55沉默)+ ICD诱导”三管齐下，根除免疫逃逸。

通用性： 该策略可增强多种T细胞相关免疫疗法(如aPD-1、CAR-T、肿瘤疫苗)的疗效。

转化意义： 为临床免疫治疗耐药性提供新解决方案，尤其适用于实体瘤。