透视生物膜：新技术让"假死"的食源性致病菌现原形

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Holistic monitoring of Campylobacter jejuni biofilms with NanoLuc bioluminescence

中文标题：应用NanoLuc生物发光技术对空肠弯曲菌生物膜进行整体监测

发表期刊：《Appl. Microbiol. Biotechnol》

影响因子：3.9

作者单位：

1. Biotechnical Faculty, Department of Food Science and Technology, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia

2. Department of Biotechnology, Jožef Stefan Institute, Ljubljana, Slovenia

3. College of Veterinary Medicine, Department of Veterinary Diagnostic and Production Animal Medicine, Iowa State University, Ames, IA, USA

作者信息：

Tjasa Cukajne, Petra Stravs, Orhan Sahin

研究背景

空肠弯曲菌(C. jejuni)作为全球主要食源性病原体，虽对环境胁迫敏感，却能通过形成生物膜或进入VBNC(可存活但不可培养)状态持续存活。传统检测方法(如结晶紫染色、平板计数)无法全面捕获生物膜中活细胞、损伤细胞及VBNC细胞的动态变化，导致对其生存策略的理解存在局限。本研究旨在开发基于NanoLuc生物发光酶的创新技术，实现对生物膜多细胞状态的实时监测，以解决现有方法在灵敏度、特异性和定量精度上的缺陷。

研究方法

研究通过分子克隆将密码子优化的NanoLuc基因插入质粒pMW10，利用三亲接合转化至致病性空肠弯曲菌株81-176中，构建发光标记菌株。生物膜在聚苯乙烯板、黏蛋白涂层表面及鸡肉汁基质中培养(42°C微需氧环境)，分别于4、8、24、48、72小时取样。NanoLuc检测采用商业化底物(Nano-Glo试剂)测量发光强度(RLU)，并与平板计数(CFU)、结晶紫染色(生物量)、刃天青染色(代谢活性)进行对比验证。方法灵敏度通过检测限(LOD: 9.12×10⁶ CFU/mL)和定量限(LOQ: 1.61×10⁷ CFU/mL)评估。

实验结果

图1. 空肠弯曲菌NanoLuc菌株的发光强度验证

通过比较携带pMW10_nLuc质粒的工程菌(红色)与空载体对照组(黑色)的发光信号，证实NanoLuc表达强度与细胞密度呈线性正相关(R²>0.98)。实验采用系列稀释菌悬液(1.88×10⁷至1.50×10⁸ CFU/mL)，工程菌发光值随浓度梯度显著上升，而对照组始终维持基线水平，验证了NanoLuc作为定量标记的可靠性，为后续生物膜研究奠定技术基础。

图2. 不同方法监测72小时生物膜动态

对比四种方法对生物膜形成的时效性响应。NanoLuc检测(A图)显示信号随培养时间持续上升(斜率>0)，72小时仍保持增长;平板计数(B图)在24–48小时达峰值后急剧下降，表明VBNC细胞积累;结晶紫染色(C图)吸光度持续增加，反映生物量累积而非活细胞数;刃天青染色(D图)代谢活性在48小时后降低(斜率<0)，与CFU减少趋势一致。四组数据共同揭示传统方法在成熟生物膜监测中的局限性。

图3. 黏蛋白表面对生物膜的影响

评估不同黏蛋白浓度(0/50/500 μg/mL)对生物膜形成的作用。NanoLuc检测显示总细胞数在各浓度间无显著差异;而平板计数表明，72小时时无涂层表面的活菌数下降最显著(P<0.05)，黏蛋白涂层组活菌保留率更高。这证实黏蛋白通过延缓VBNC转化增强细菌存活，同时凸显NanoLuc在量化不可培养细胞方面的优势。

图4. 鸡肉汁基质中的生物膜形成

探究食品基质(鸡肉汁)对生物膜的促进作用。NanoLuc检测显示24小时和48小时总细胞数与对照组(MH培养基)无差异;但平板计数表明鸡肉汁中活菌数显著更高(P<0.01)，说明其营养组分加速细菌增殖。两者结合揭示鸡肉汁通过双重机制(促进增殖+提供保护)增强生物膜风险，为食品加工环境防控提供依据。

图5. 与沙门氏菌的混合生物膜竞争

分析空肠弯曲菌在混合生物膜中的竞争存活。NanoLuc检测到目标菌数量显著高于平板计数结果(P<0.05)，证明沙门氏菌共存未抑制其生物膜形成，且传统方法低估了实际负载量。该发现警示多物种生物膜在食品链中的协同风险，凸显NanoLuc在复杂体系中的定量优势。

研究结论

NanoLuc技术成功实现对空肠弯曲菌生物膜的全细胞状态(活细胞、损伤细胞、VBNC细胞)动态监测，其灵敏度显著优于传统方法。在72小时成熟生物膜中，平板计数显示活菌数下降50%，而NanoLuc信号稳定增长，证实其可捕获VBNC细胞;在黏蛋白表面和鸡肉汁基质中，NanoLuc定量结果与生物膜实际负载量一致，且能特异性检测混合生物膜(与沙门氏菌共培养)中的目标菌。该技术为非侵入式实时监测提供新工具，未来需结合显微技术深化生物膜结构解析，以指导食品安全生产中的风险控制。