全长 GSDME 介导不依赖裂解的细胞焦亡

基本信息

英文标题：Full-length GSDME mediates pyroptosis independent from cleavage

中文标题：全长 GSDME 介导不依赖裂解的细胞焦亡

发表期刊：《Nature Cell Biology》

影响因子：17.3

作者单位：

厦门大学生命科学学院细胞应激生物学国家重点实验室

作者信息：

Bo Zhou1,2, Zhi-hong Jiang1,2, Meng-ran Dai1,2, Yuan-li Ai1, Li Xiao1, Chuan-qi Zhong1, Liu-Zheng Wu1, Qi-tao Chen1, Hang-zi Chen,Qiao Wu

研究背景

细胞焦亡的经典机制:细胞焦亡(pyroptosis)是一种由gasdermin(GSDM)家族蛋白介导的程序性细胞死亡形式。传统观点认为，GSDM蛋白需要被蛋白酶切割，释放其N端片段(GSDM-NT)，才能转移到细胞膜上形成孔洞，从而执行焦亡。C端结构域(GSDM-CT)通常通过分子内相互作用抑制N端结构域的活性，维持GSDM的自抑制状态。

GSDM的激活方式多样性:除了蛋白酶切割外，GSDM的激活还可能通过其他机制实现，例如：通过突变破坏C端和N端结构域之间的相互作用界面。通过氧化或棕榈酰化等翻译后修饰改变蛋白构象。

活性氧(ROS)在焦亡中的作用:ROS通过氧化蛋白质中的半胱氨酸残基，形成分子内或分子间二硫键，从而调控蛋白质功能。已有研究表明Tom20通过氧化感知ROS，启动黑色素瘤细胞中的GSDME介导的焦亡。死亡受体6(DR6)感知α-酮戊二酸增强的ROS，促进GSDMC介导的焦亡。谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的缺失会增强caspase-11对GSDMD的切割，从而诱导焦亡。

紫外线(UVC)辐射与细胞死亡:UVC是短波紫外线(200–280 nm)，具有强破坏性，可诱导多种细胞死亡形式(如凋亡、NETosis、坏死性凋亡等)。然而，UVC诱导焦亡的研究较少。

研究方法

细胞实验

(1)细胞培养与处理

细胞系：人类细胞：HeLa(宫颈癌细胞)、A375(黑色素瘤细胞)、A549(肺癌细胞)、SW620(结肠癌细胞)等。

小鼠细胞：B16(黑色素瘤细胞)、Panc02(胰腺癌细胞)。

对照细胞：HEK293T(用于转染实验)。

UVC照射：使用254 nm UVC光源，剂量为50–200 mJ/cm²。

(2)基因操作

基因敲除(KO)：

使用CRISPR-Cas9技术构建GSDME-KO细胞系(单克隆筛选)。

基因敲降(KD)：

使用shRNA或siRNA靶向GSDME、PARP1、PARP5a/b、DRP1、MFF、cyt.c等基因。

基因过表达：

构建GSDME-Flag/HA、GSDME突变体(如C156S/C180S、D229A/E233A)等质粒，通过脂质体转染或慢病毒感染导入细胞。

(3)细胞死亡检测

焦亡形态观察：显微镜下观察细胞肿胀、膜破裂等焦亡特征。

PI/Hoechst 33342染色：焦亡细胞膜破裂，PI(碘化丙啶)进入细胞核染色，计算PI阳性率。

Annexin V/PI双染：区分凋亡(Annexin V+ PI−)和焦亡(Annexin V+ PI+)。

分子机制研究

(1)蛋白质修饰分析

PARylation检测：使用PAR抗体检测GSDME的PAR修饰。

抑制PARP1(rucaparib/olaparib)或PARP5(K756)验证依赖性。

氧化寡聚化检测：非还原性SDS-PAGE：观察GSDME的高分子量寡聚体(二硫键依赖)。

质谱分析：鉴定Cys156/Cys180形成分子间二硫键。

(2)亚细胞定位

细胞组分分离：分离胞质、细胞膜(PM)、线粒体、细胞核组分，检测GSDME分布。

免疫荧光(IF)：使用Flag/Tom20(线粒体标记)共定位分析GSDME的膜靶向。

(3)脂质ROS与线粒体功能

脂质ROS检测：BODIPY C11荧光探针(氧化后荧光由红变绿)。

抑制剂：Fer-1(ferroptosis抑制剂)、DFO(铁螯合剂)。

线粒体ROS(mito-ROS)检测：MitoSOX(超氧化物特异性荧光探针)。

心磷脂(cardiolipin)氧化：NAO(10-壬基吖啶橙)荧光减弱反映心磷脂过氧化。

(4)PARP1/PARP5通路

PARP1激活：UVC诱导DNA损伤(γ-H2AX检测)，激活PARP1生成PAR聚合物。

PARP5介导的GSDME PARylation：Co-IP验证PARP5与GSDME的相互作用。

体外PARylation实验：纯化PARP5和GSDME，加入NAD+检测修饰。

结构生物学方法

(1)构象变化检测

DDDDK-Flag暴露实验：在GSDME的C端与N端结合界面插入Flag标签，通过抗Flag抗体免疫沉淀检测构象变化。

(2)脂质结合与膜穿孔

脂质体结合实验：使用牛肝极性脂质提取物制备脂质体，检测GSDME结合能力。

负染电镜：观察GSDME在脂质体上形成的孔洞结构。

动物模型

(1)肿瘤抑制实验

裸鼠异种移植模型：皮下注射HeLa细胞(对照、GSDME-KD、GSDME突变体)，用RSL3(GPX4抑制剂)+ carmustine(DNA损伤剂)联合治疗，观察肿瘤生长抑制。

免疫活性小鼠模型(C57BL/6J)：皮下注射B16-GSDME过表达细胞，评估焦亡的免疫原性(CD8+ T细胞、NK细胞浸润)。

(2)免疫细胞分析

流式细胞术(FACS)：检测肿瘤微环境中CD8+ T细胞、NK细胞、IFN-γ、穿孔素(perforin)等免疫标志物。

数据分析

Western Blot定量：ImageJ软件。

统计学分析：GraphPad Prism 9(ANOVA、Tukey检验)。

质谱数据：ProteomeXchange(PXD051840)。

实验结果

图1：UVC照射下FL-GSDME诱导的焦亡

HeLa细胞在UVC 200 mJ cm−²照射下，有或无不同抑制剂预处理，然后培养1小时检测脂质ROS和GSDME质膜靶向，3小时检测GSDME氧化，4小时显示焦亡形态及PI阳性率(%)，除非另有说明。

图(a)细胞中GSDME被敲低并检测焦亡。

图(b)准备细胞质膜部分后进行western印迹。

图(c–g)细胞用Fer-1 (2 μM，2 h)预处理，检测脂质ROS (c)、焦亡(d)、GSDME质膜靶向(e和f，左)、细胞质中GSDME表达水平(Cyto)、质膜或核中GSDME表达水平(Nuc)(f，右)以及GSDME氧化(g，右)。分别转染GSDME-HA或GSDMD-HA进入细胞并检测GSDME氧化(g，左)。

图(h–k)GSDME或GSDME2CS分别转染到细胞中，显示了GSDME氧化(h)、焦亡(i)和GSDME质膜靶向(j，k)。

图(l)转染不同标记的GSDME构建体的细胞接受了UVC照射。随后，使用含1% SDS的裂解液收集细胞，并煮沸5分钟以确保蛋白质完全变性。裂解液中的SDS浓度稀释至0.5%，然后用Strep-Tactin Sepharose珠子沉淀。显示了非还原凝胶中高分子量复合物中的GSDME。使用微管蛋白测定上样蛋白的量。LDHA和Na+/K+-ATP酶用于指示输入、胞浆和质膜中的上样蛋白量。统计数据显示为mean ± s.e.m.(n=3)三次独立实验的结果。统计分析采用双因素方差分析(ANOVA)结合Tukey多重比较检验(a，c–e，j)和单因素方差分析结合Tukey多重比较检验(i)。标出了P值。所有western blot实验至少重复两次，其中一次结果如图所示。IB，免疫印迹;KD，敲低;DAPI，4,6-二氨基-2-苯基吲哚;WT，野生型。

图2：MFF/DRP1在脂质ROS升高和焦亡诱导中的作用

HeLa细胞经UVC 200 mJ cm−²照射，有或无不同抑制剂预处理，然后培养1小时检测线粒体形态、脂质ROS、线粒体ROS和GSDME质膜靶向，3小时显示GSDME氧化，4小时显示焦亡形态及PI阳性率(%)，除非另有说明。

图(a)将Tom20-BFP质粒转染入细胞，通过BODIPY C11荧光染色观察脂质ROS。

图(b–f)分别敲低细胞中的MFF或DRP1;显示线粒体形态(b)、脂质ROS水平(c)、GSDME氧化(d)、质膜靶向(e)和焦亡(f)。

图(g)细胞用Mito-Q (2 μM，2 h)预处理;显示线粒体ROS和脂质ROS水平。

图(h)MFF和DRP1分别被敲低，并检测了线粒体ROS的水平。

图(i)细胞用Fer-1 (2 μM，2 h)预处理后，检测了线粒体ROS水平。使用微管蛋白测定加载蛋白的量。LDHA和Na+ /K+ -ATPase分别用于指示输入和质膜中加载蛋白的量。Hsp60用于指示线粒体。统计数据显示为mean ± s.e.m.(n=3)，三次独立实验的结果。统计分析采用两因素方差分析结合Tukey多重比较检验(c，f–i)。P值已标出。所有western印迹至少重复两次，此处仅展示其中一次结果。

图3：细胞色素c诱导心磷脂氧化以提高脂质活性氧水平

HeLa细胞经UVC照射200 mJ cm−²，有或无不同抑制剂预处理，然后培养1小时检测线粒体活性氧、脂质活性氧、细胞色素c过氧化物酶活性、心磷脂氧化、GSDME质膜靶向及MOM中心磷脂含量，3小时显示GSDME氧化，4小时显示焦亡形态和PI阳性率(%)，除非另有说明。

图(a–d)检测细胞色素c敲低细胞中的GSDME氧化(a)和质膜靶向(b)，焦亡(c)及脂质活性氧水平(d)。显示GSDME寡聚化的定量结果(a，右)。

图(e)细胞用Mito-Q (2 μM，2 h)预处理，指示细胞色素c过氧化物酶活性。

图(f)检测MFF或DRP1敲低细胞中的细胞色素c过氧化物酶活性。

图(g–j)检测HCCS或CRLS1敲低细胞中的脂质活性氧水平(g)、线粒体活性氧水平(h)、质膜靶向(i)及焦亡(j)。

图(k)通过NAO染色检测了心磷脂的氧化。

图(l-n)在Fer-1 (2 μM，2 h)(左)或Mito-Q (2 μM，2 h)预处理的细胞中，或MFF、DRP1、cyt.c或HCCS敲低的细胞中检测了心磷脂的氧化。

图(o)使用抗心磷脂抗体定量了MOM中的心磷脂含量，对照组(左)或PLSCR3敲低的HeLa细胞(右)。

图(p，q)在PLSCR3敲低的细胞中检测了GSDME氧化(p)和焦亡(q)。微管蛋白用作上样对照。LDHA和Na+/K+-ATP酶分别用于指示输入或质膜中的上样蛋白量。统计数据显示为mean ± s.e.m.(n=6)，六个独立实验(右)和(n = 3)，三个独立实验(其他)。统计分析采用双因素方差分析结合Tukey多重比较检验(a，c–g，j，l–n，o(右)和q)和非配对双尾t检验(k，o(左))。P值已标出。所有western印迹至少重复两次，其中一次显示。

图4：PARP1诱导的PAR释放对于GSDME PAR化是必需的

HeLa细胞用UVC以200 mJ cm−²剂量照射，有或没有不同抑制剂的预处理，然后培养10分钟以显示总PAR化(总-PAR)和GSDME PAR化(GSDME-PAR)，1小时检测GSDME质膜靶向，3小时显示GSDME氧化，4小时显示焦亡形态和PI阳性率(%)，除非另有说明。

图(a)分别敲低PARP1或PARP2并检测总PAR化。

图(b–d)敲低PARP1;显示GSDME氧化(b)、质膜靶向(c)和焦亡(d)。

图(e–h)在PARP1敲低细胞中，分别引入PARP1WT或PARP1E988Q;显示PAR生成(e)、GSDME氧化(f)、质膜靶向(g)和焦亡(h)。

图(i，j)过表达GSDME-链球菌-Flag的细胞用rucaparib (20 μM，2 h)预处理(i，左)或在GSDME-链球菌-Flag表达细胞中分别敲低PARP1或PARP2。.在用链霉亲和素Sepharose珠子下拉GSDME后，检测到了GSDME的PAR化。GSDMD作为阴性对照(i，右)。

图(k)细胞预先用鲁卡帕利(20 μM，2 h，左)处理或敲低PARP1(右)，随后进行UVC照射。培养10分钟后，检测到胞质中的游离PAR(上)。为了排除核污染，在核部分显示了组蛋白H3的表达，而在胞质部分则未显示。使用微管蛋白测定加载蛋白的量。LDHA和Na+/K+-ATP酶分别用于指示输入或质膜中加载蛋白的量。统计数据显示为三次独立实验的mean ± s.e.m.(n = 3)。统计分析采用双因素方差分析结合Tukey多重比较检验(d)和单因素方差分析结合Tukey多重比较检验(h)。P值已标出。所有western印迹至少重复两次，其中一次结果展示。

图5：细胞质PARP5催化GSDME PAR化

HeLa细胞经UVC照射200 mJ cm−²后，培养10分钟显示总PAR和GSDME-PAR，1小时检测GSDME质膜靶向，3小时表明GSDME氧化，4小时检测焦亡，除非特别说明。

图(a)用HeLa细胞免疫沉淀的PARP5a或PARP5b蛋白与硝酸纤维素膜孵育1小时，加入PARP1生成的PAR，并用PAR抗体进行免疫印迹(左)。体外GSDME PAR化实验在有或无PAR和NAD+孵育条件下进行(右)。

图(b)在表达GSDME-Strep-Flag的细胞中同时敲低PARP5a和PARP5b。通过Strep-Tactin Sepharose珠子下拉GSDME后，显示GSDME-PAR(左)和总PAR(右)。

图(c-e)在敲低PARP5a和PARP5b的细胞中检测GSDME氧化(c)、质膜靶向(d)和焦亡(e)。f，表达GSDME-Strep-Flag的细胞裂解物与羟胺(0.21 M，30分钟)孵育。通过Strep-Tactin Sepharose珠子下拉GSDME后，检测GSDME PAR化。

图(g、h)GSDMEWT或GSDMED229/E233A被转染到GSDME敲低细胞中。显示了GSDME的质膜定位。

图(i)gsdmewt-Strep–Flag或GSDMED229/E233A–Strep–Flag被拉下，GSDME的PAR修饰被标记。j、进行了GSDMEWT-PAR和GSDMED229/E233A-PAR的体外实验。

图(k)来自表达GSDMEWT或GSDMED229/E233A的细胞的裂解物与羟胺或10%的β-巯基乙醇孵育，检测了GSDME的氧化情况。l、GSDMEWT或GSDMED229/E233A被转染到GSDME敲低细胞中。显示了焦亡现象。微管蛋白作为加载对照。LDHA和Na+ /K+ -ATPase分别用于指示输入或质膜中的加载蛋白量。统计数据显示为mean ± s.e.m.(n=3)三次独立实验的结果。统计分析通过两因素方差分析和Tukey多重比较检验(e、g)以及单因素方差分析和Tukey多重比较检验(l)进行。P值已标明。所有western印迹至少重复两次，其中一次结果展示。

图6：UVC照射诱导GSDME构象变化并靶向PM穿孔

HeLa细胞在200 mJ cm−²的UVC照射下，有或没有不同抑制剂预处理，然后培养15分钟以显示GSDME构象变化，除非另有说明。

图(a，b)不同的GSDME-HA突变体(突变位点标记有Flag(DDDDK)在扩展数据图7a中显示)分别转染到细胞中，有或没有预先处理rucaparib (20 μM，2 h)或Fer-1 (2 μM，2 h)，如所示。制备裂解液后，使用抗Flag磁珠进行免疫沉淀。免疫沉淀物中GSDME-HA的增加表明GSDME的构象改变(方法)。

图(c)构建了GSDMED229/E233A(左)或GSDME2CS(右)在GSDME-mut2-HA中，UVC诱导的GSDME构象变化如图所示。

图(d，e)GSDME–Flag被转染到细胞中，随后使用Flag抗体免疫沉淀GSDME并用3×Flag肽洗脱。洗脱样品分别与脂质条(d)或由牛肝来源的极性脂质提取物制备的脂质体(e)孵育，GSDME结合磷脂的能力被指示。

图(f)UVC诱导GSDME打穿脂质体，如代表性负染电子显微镜图像所示。

图(g，h)细胞被转染了GSDMED229/E233A (g)或GSDME2CS (h)，或预处理了rucaparib (g)和Fer-1 (h)，具体如所示。GSDME与脂质体之间的相互作用被指示。所有western印迹至少重复两次，其中一次显示。

图7：临床药物组合诱导小鼠模型中的焦亡并抑制肿瘤生长

图(a-f)HeLa细胞用过氧化氢(1 mM)、维生素C(1 mM)或β-拉帕乔酮(5 μM)处理5小时以显示焦亡形态(a)，1小时以显示GSDME PAR化(GSDME-PAR)(b)、GSDME构象变化(c)和脂质ROS水平(d)，3小时检测GSDME质膜靶向(f)和4小时显示GSDME氧化(e)。

图(g)卡莫司汀(10 mg/kg−1)、RSL3(10 mg/kg−1)或卡莫司汀/RSL3联合用药每两天一次腹腔注射给携带HeLa细胞衍生异种移植瘤的小鼠，持续两周。显示裸鼠异种移植瘤图像及肿瘤重量(n = 8)。PBS作为对照。

图(h，i)卡莫司汀和RSL3用于治疗携带对照组、GSDME敲低(h，n = 8)或表达GSDME2CS或GSDMED229/E233A的HeLa细胞衍生异种移植瘤(i，n = 7)的小鼠。显示异种移植瘤及其相应肿瘤重量。

图(j)携带GSDME过表达的小鼠黑色素瘤B16细胞异种移植瘤的C57BL/6J小鼠，每日腹腔注射卡莫司汀(20 mg/kg−1)和RSL3 (10 mg/kg−1)，持续1周。异种移植瘤及其相应的肿瘤重量已标明(n = 7)。PBS作为对照。

图(k)在卡莫司汀(10 mg/kg−1)和RSL3(10 mg/kg−1)给药后24小时收集B16细胞衍生的异种移植瘤，并通过流式细胞术分析肿瘤微环境中免疫细胞的比例和活化状态(n = 4)。统计数据显示为三次独立实验的mean ± s.e.m.(d，n = 3)或每组n = 8 (g)，n = 8 (h)，n = 7 (i)，n = 7 (j)和n = 4 (k)小鼠。统计分析采用非配对双尾t检验(d，k)。P值已标出。g至k组实验仅进行一次。所有western印迹至少重复两次，其中一次结果展示。

研究结论

本研究揭示了全长GSDME(FL-GSDME)在未被蛋白酶切割的情况下，通过PARylation和氧化作用激活并诱导焦亡的新机制，主要结论如下：

FL-GSDME可在不依赖切割的情况下诱导焦亡

传统观点：GSDM家族蛋白(如GSDMD、GSDME)需被caspase等蛋白酶切割，释放N端片段(GSDM-NT)才能执行焦亡。

本研究发现：

高强度UVC辐射(200 mJ/cm²)可诱导FL-GSDME介导的焦亡，且不依赖caspase切割(即使突变GSDME的caspase切割位点D267/D270仍有效)。

关键证据：UVC处理后，未检测到GSDME切割片段，但FL-GSDME仍能寡聚化并靶向细胞膜形成孔洞。

两条关键信号通路协同激活FL-GSDME

(1)PARylation通路：解除自抑制

PARP1激活：UVC诱导DNA损伤 → 激活核内PARP1 → 生成PAR聚合物(poly-ADP-ribose)。

PARP5介导的GSDME修饰：

PAR释放到胞质 → 激活PARP5(PARP5a/b)→ 催化GSDME的PARylation(主要发生在D229/E233位点)。

功能：PARylation引起GSDME构象变化，解除C端对N端的自抑制。

(2)氧化通路：促进寡聚化与膜靶向

线粒体ROS(mito-ROS)：UVC诱导线粒体分裂(依赖DRP1/MFF)→ 升高mito-ROS。

细胞色素c(cyt.c)的作用：mito-ROS增强cyt.c的过氧化物酶活性 → 催化心磷脂(cardiolipin)过氧化 → 生成脂质ROS。

脂质ROS通过PLSCR3转运至线粒体外膜，氧化GSDME的Cys156/Cys180，形成分子间二硫键，促进寡聚化。

最终效应：氧化寡聚化的FL-GSDME靶向细胞膜穿孔，引发焦亡。

PARylation与氧化缺一不可

单独PARylation(如仅用DNA损伤剂)或单独氧化(如仅用RSL3)均不能有效诱导焦亡。

协同作用：只有当PARylation解除自抑制 + 氧化促进寡聚化时，FL-GSDME才能完全激活。

生理与治疗意义

(1)抗肿瘤应用

联合治疗策略：

DNA损伤剂(如carmustine) + 脂质ROS诱导剂(如RSL3)可协同激活FL-GSDME，显著抑制肿瘤生长(在HeLa和B16移植瘤模型中验证)。

免疫激活：FL-GSDME介导的焦亡释放促炎因子，增强CD8+ T细胞和NK细胞的肿瘤浸润与活化(IFN-γ、穿孔素表达升高)。

(2)拓展焦亡的调控范式

除蛋白酶切割外，翻译后修饰(PARylation、氧化)和构象变化是GSDM蛋白激活的新机制。

为开发靶向GSDME的癌症疗法(如PARP抑制剂联合氧化应激诱导剂)提供理论依据。