中国科学家发现抗流感新靶点！硒蛋白M成病毒“克星”

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。

NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Selenoprotein M Inhibits the Replication of Influenza A Virus by Regulating Reactive Oxygen Species Levels

中文标题：硒蛋白M通过调节活性氧水平抑制甲型流感病毒复制

发表期刊：《LIFE-BASEL》

影响因子：3.2

作者单位：

1. College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China

2. State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, Key Laboratory of Veterinary Parasitology of Gansu Province, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Science, Lanzhou 730046, China

3. Animal Husbandry and Veterinary Station of Zhenyuan County, Zhenyuan 744500, China

4. Gansu Agriculture Technology College, Duanjiatan 425, Lanzhou 730030, China

作者信息：

Minxuan Liu, Jinhui Wang, Weigang Li, Bo Zhao

研究背景

甲型流感病毒(IAV)是引发季节性流感与全球大流行的主要病原体，感染可导致活性氧(ROS)水平异常升高，进而诱发细胞凋亡、肺组织损伤等病理反应。前期研究表明，硒蛋白可能通过抗氧化途径抑制IAV复制，但具体分子机制不明。本文聚焦硒蛋白M(SelM)——一种依赖硒半胱氨酸(Sec)功能位点的内质网氧化还原调节蛋白，探究其是否通过调控ROS影响IAV复制。研究旨在填补以下空白：

① SelM对IAV复制的直接作用;

② SelM-ROS通路的具体机制;

③ Sec位点的功能必要性，为开发广谱抗病毒策略提供新靶点。

研究方法

研究采用细胞与病毒模型(A549、HEK293细胞;IAV PR8/H1N1毒株及Nanoluc-IAV-PR8荧光报告病毒)，通过多维度技术验证SelM功能：

1. 基因操作：构建Flag-SelM过表达质粒、siRNA干扰序列、CRISPR/Cas9敲除细胞系(SelM-KO);

2. 功能检测：利用纳米荧光素酶报告系统(Nanoluc)定量病毒复制，qPCR/Western blot分析病毒NP基因及蛋白表达;

3. ROS机制验证：DCFH-DA荧光探针动态监测ROS水平，结合抑制剂(Auranofin)和诱导剂(H₂O₂)干预;

4. 关键位点解析：设计Sec→Ser突变体(SelM Sec/Ser mut)及终止密码子突变体(SelM Sec/*mut)，验证Sec活性位点必要性;

5. 统计方法：GraphPad Prism 6.0进行ANOVA/t检验，显著性阈值设为*p<0.05。

实验结果

图1：SelM剂量依赖性抑制IAV复制

通过siRNA敲低、质粒过表达及剂量梯度实验，证实SelM对IAV复制的抑制作用。关键结果：① siRNA-SelM组病毒Nanoluc活性升高1.8倍(p<0.05);② SelM过表达使病毒NP mRNA降低70%(p<0.001);③ 随SelM质粒剂量增加(200–1500 ng)，病毒滴度呈阶梯式下降(p<0.01)，明确剂量效应。

图2：SelM缺失解除对IAV复制的抑制

利用SelM-KO细胞系揭示SelM缺失的生物学后果：

① KO细胞活性未受影响(CCK-8验证);

② IAV在KO细胞中复制增强(滴度为野生型1.5倍，p<0.01);

③ 回补SelM后抑制功能恢复，而硒代蛋氨酸(Se-Met)在KO细胞中失效，证明SelM是硒抗病毒的核心介质。

图3：IAV感染上调SelM表达并定位于胞质

解析IAV与SelM的互作模式：

① SelM蛋白表达依赖Se-Met浓度;

② IAV感染24小时诱导SelM mRNA上调2.5倍(p<0.001);

③ 免疫荧光显示SelM(红色)主要定位于细胞质，与病毒NP蛋白(绿色)共定位，提示其直接干预病毒复制场所。

图4：SelM-ROS通路是抑制IAV的关键

阐明ROS的核心枢纽作用：

① SelM过表达使ROS降低60%(p<0.0001)，且呈剂量依赖性;

② ROS抑制剂(Auranofin)可抵消si-SelM的促病毒效应，而诱导剂(H₂O₂)加剧复制;

③ SelM与Auranofin联用协同抑制病毒(滴度降幅>2倍，p<0.001)，证实ROS清除是SelM抗病毒的主要机制。

图5：Sec位点突变消除SelM抗病毒功能

验证Sec位点的不可替代性：

① 构建Sec→Ser(Sec/Ser mut)及终止密码子突变(Sec/*mut);

② 突变体完全丧失ROS调控能力(与空载体比p>0.05);

③ 在野生型或KO细胞中，突变体均无法抑制IAV复制(滴度与对照组无差异);

④ Auranofin处理无法挽救突变体功能，确证Sec是SelM抗氧化及抗病毒活性的结构基础。

研究结论

本研究首次证实SelM通过调控ROS水平显著抑制IAV复制，且该功能严格依赖其Sec活性位点。核心结论如下：

1. 抗病毒效应：SelM过表达剂量依赖性降低IAV复制(病毒滴度下降>50%，p<0.001)，而SelM敲除则增强病毒复制;

2. 机制通路：IAV感染诱导ROS爆发以促进自身复制，SelM作为氧化还原调节剂清除ROS，阻断该正反馈循环(ROS降幅达60%，p<0.0001);

3. 位点依赖性：Sec突变体(Ser/*mut)完全丧失ROS调控能力，病毒抑制效果消失(与野生型比p>0.05)，证实Sec为功能核心;

4. 临床关联：中国硒缺乏地区(如陕西)流感发病率显著高于富硒区(如贵州)，为SelM的流行病学意义提供佐证。SelM有望成为抗IAV新靶点。