给PROTAC装上“肝脏导航仪”？Science子刊揭示靶向降解新技术，抗癌活性提升10倍

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：An NTCP-mediated liver-targeting chimeras (NTLiverTac) design strategy and its application to hepatoblastoma models

中文标题：NTCP介导的肝脏靶向嵌合体(NTLiverTac)设计策略及其在肝母细胞瘤模型中的应用

发表期刊：《Bioorganic Chemistry》

影响因子：4.5

作者单位：

1.Wuya College of Innovation, Key Laboratory of Structure-Based Drug Design & Discovery, Ministry of Education, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang

110016, China

2.Institute of Structural Pharmacology & TCM Chemical Biology, College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China

作者信息：

Jing Lianga, Weihong Luob, Wen Xub

研究背景

肝母细胞瘤(HB)因高复发率及现有化疗药物的严重毒性(神经毒性、心脏毒性、肝肾功能障碍)亟需新疗法。本研究提出NTCP介导的肝脏靶向嵌合体(NTLiverTac)策略：通过胆酸(CA)靶向肝脏高表达的胆汁酸转运蛋白(NTCP)，将PROTAC分子递送至肝母细胞瘤细胞(如HuH-6)，以增强选择性并降低脱靶毒性。

研究方法

通过两代结构优化合成25个NTLiverTac化合物(Scheme1-2)，采用CCK-8法评估抗增殖活性，WesternBlot检测PDE6D降解及KRAS通路蛋白表达，Co-IP验证PDE6D-KRAS相互作用，HPLC分析细胞摄取，免疫荧光观察NTCP共定位，GST-KRASPull-down检测KRAS活性，并结合克隆形成、流式细胞术评估增殖抑制与凋亡诱导效应。

实验结果

图1：第二代NTLiverTac化合物筛选及S2C2M2的降解活性

本研究通过两代结构优化合成25个NTLiverTac化合物。图1A显示第二代化合物的抗增殖活性筛选结果：当横向连接子(索拉非尼至E3配体)固定为21个原子、纵向连接子(丝氨酸接头至CA)为5个原子时，S2C2M2(结构见图1B)在HuH-6细胞中表现出最强抑制活性(IC50=7.46±0.70μM)。浓度依赖性实验(图1C)证实其显著优于索拉非尼(IC50=10.94μM)。Westernblot分析进一步揭示S2C2M2以浓度依赖性(图1D，DC50=4.09μM)和时间依赖性(图1E，72小时降解70%PDE6D)方式诱导靶蛋白PDE6D降解。该结果确立S2C2M2为后续机制研究的先导化合物。

图2：S2C2M2通过泛素-蛋白酶体系统降解PDE6D

为明确降解机制，研究采用抑制剂阻断实验。图2A-B显示：

1.蛋白酶体抑制剂MG132和neddylation活化抑制剂MLN4924预处理可完全阻断S2C2M2对PDE6D的降解，证实其依赖泛素-蛋白酶体途径。

图2C-D中，MDM2配体Nutlin2.3a和索拉非尼竞争性抑制降解(**p<0.01)，表明S2C2M2通过形成"PDE6D-降解剂-MDM2"三元复合物发挥作用。这些证据共同验证了S2C2M2的PROTAC经典作用模式：招募E3连接酶MDM2，泛素化标记PDE6D并引导其蛋白酶体降解。

图3：NTCP介导S2C2M2细胞内吞及靶向递送机制

本研究核心创新点在于利用NTCP实现肝脏靶向。图3A通过HPLC检测证实：S2C2M2可被HuH-6细胞有效摄取(保留时间11.29min)，而游离CA、索拉非尼等组分无干扰峰。机制上：

1.CA预处理(图3B)及NTCP抑制剂MyrcludexB(图3C)显著抑制降解(###p<0.001)，证明其依赖NTCP介导的内吞作用。

2.免疫荧光实验(图3D)采用萘酰亚胺荧光探针S2C2-NAP(S2C2M2类似物)与NTCP抗体共定位，显示二者在细胞膜及胞内囊泡中高度重叠(黄色信号)，直观证实NTCP是S2C2M2的细胞入口。

图4：S2C2M2抑制PDE6D依赖性KRAS膜转运及激活

PDE6D作为KRAS的分子伴侣，调控其膜定位与活性。图4A显示S2C2M2处理同时下调PDE6D和KRAS蛋白水平。Co-IP实验(图4B)证实降解后PDE6D-KRAS相互作用减弱(***p<0.001)。功能上：

1.亚细胞分级实验(图4C)显示KRAS在细胞膜占比显著降低(**p<0.01)，胞质滞留增加。

2.GST-Raf1-RBDpull-down检测(图4D)表明活性形式GTP-KRAS减少60%(***p<0.001)。这些结果阐明S2C2M2通过降解PDE6D破坏KRAS膜转运，抑制其致癌活性。

图5：S2C2M2抑制PI3K/AKT/mTOR通路并诱导细胞凋亡

基于KRAS信号抑制，研究深入探索下游效应。图5A显示：S2C2M2浓度依赖性抑制EGF诱导的PI3K/AKT/mTOR磷酸化(如p-AKTS473降低70%)。表型上：

1.克隆形成实验(图5B)证实S2C2M2(7.5–30μM)显著减少细胞增殖(***p<0.001)。

2.流式细胞术(图5C)显示凋亡率从6.3%(对照)升至41.2%(30μM)。

3.Westernblot(图5D)揭示促凋亡蛋白BAX、cleavedPARP/Caspase3上调，抗凋亡蛋白Bcl-2下调。这些数据证明S2C2M2通过阻断KRAS-PI3K通路触发线粒体凋亡，抑制HB进展。

研究结论

NTLiverTac策略成功实现PROTAC的肝脏靶向递送，最优化合物S2C2M2通过NTCP介导的内吞作用进入HuH-6细胞，以蛋白酶体依赖方式降解PDE6D(DC50=4.09μM)，破坏PDE6D-KRAS相互作用，抑制KRAS膜定位及激活，进而下调PI3K/AKT/mTOR信号通路并诱导凋亡。该策略为肝母细胞瘤提供首个NTCP-PROTAC靶向治疗平台，可拓展至其他肝脏疾病靶点。