FLuc标记技术揭秘：脂质纳米颗粒如何优化环状RNA疫苗，激活强力T细胞免疫？

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Investigation of the Impact of Lipid Nanoparticle Compositions on the Delivery and T Cell Response of circRNA Vaccine

中文标题：脂质纳米颗粒组成对环状RNA疫苗递送及T细胞应答的影响研究

发表期刊：《J Control Release》

影响因子：10.5

作者单位：

1.Department of Pharmaceutics, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University, Richmond, VA 23298, USA

2.Department of Pharmaceutics, College of Clinical Pharmacy, Imam Abdulrahman Bin Faisal University, Dammam 31441, Saudi Arabia

3.Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Michigan, Ann Arbor, MI 48109, USA

作者信息：

Yasir Alshehry, Xiang Liu, Yu Zhang

研究背景

环状RNA(circRNA)是一种新兴的疫苗形式，可用于癌症免疫治疗等疾病。脂质纳米颗粒(LNPs)在mRNA疫苗中表现出色，但作为circRNA疫苗载体的潜力尚未充分探索。本研究旨在通过系统评估不同LNP组成(包括6种可电离脂质、3种辅助脂质及胆固醇/β-谷甾醇比例)对circRNA疫苗递送效率、蛋白表达及T细胞应答的影响，优化LNPs用于免疫细胞靶向递送。

研究方法

本研究通过系统评估脂质纳米颗粒(LNPs)的组成对环状RNA(circRNA)疫苗递送效率的影响。首先，利用T4 RNA连接酶合成两种小circRNA疫苗(circRNA-SIINFEKL和circRNA-E7)，并通过PAGE电泳验证其完整性。随后，采用乙醇注入法制备不同配方的LNPs，调整可电离脂质(SM-102、MC3等)、辅助脂质(DOPE、DSPC等)及胆固醇/β-谷甾醇比例(38.5%总含量)。体外实验评估LNPs的理化性质(粒径、PDI、zeta电位、包封率)、DC2.4细胞转染效率(荧光素酶表达)及细胞毒性(CellTiter-Glo法)。体内实验通过小鼠足垫皮下注射LNPs，利用IVIS成像检测引流淋巴结(LNs)的蛋白表达，并通过流式细胞术分析抗原特异性CD8+ T细胞应答(SIINFEKL/H-2Kb或HPV-16 E7 MHC-I四聚体染色)。数据采用ANOVA和Tukey HSD检验进行统计分析。

实验结果

图1：展示了circRNA疫苗的设计与验证

1a图示了circRNA结构，包含抗原编码序列(CDS)、Kozak序列和IRES元件，确保高效翻译。1b-c通过变性PAGE电泳验证了circRNA-SIINFEKL和circRNA-E7的纯度和完整性，排除了线性RNA污染，为后续实验奠定基础。

图2：比较了六种可电离脂质LNPs的理化性质和体外性能

2a-d显示所有LNPs粒径均约100 nm，PDI<0.2，包封率>90%，但cKK-E12 LNPs的zeta电位较低(-13.64 mV)。2e表明高浓度(2 μg/mL)时，OF-C4-Deg-Lin LNPs细胞毒性最强(存活率50%)，而ALC-0315毒性最低。2f证实SM-102 LNPs在DCs中荧光素酶表达显著高于其他组(p<0.001)，凸显其优异的转染能力。

图3：通过小鼠足垫注射评估LNPs的体内递送效率

SM-102和ALC-0315 LNPs在引流淋巴结(PO LNs)中荧光信号最强(6 h和24 h)，而MC3表现最差，表明可电离脂质的pKa和结构影响淋巴结靶向递送。

图4：显示SM-102和ALC-0315 LNPs装载circRNA-SIINFEKL后，能诱导最高比例的SIINFEKL特异性CD8+ T细胞(流式数据见Fig. S1)，证实其免疫激活优势。

图5：对比三种磷脂(DOPE、DSPC、9A1P9)的作用

DOPE LNPs的蛋白表达显著高于DSPC(p<0.05)，因其促进内体膜融合，但9A1P9未达预期效果，可能与SM-102的协同作用不足有关。

图6：探讨胆固醇/β-谷甾醇比例的影响

6a显示50%胆固醇+50%β-谷甾醇(F3)体外转染效率最高，但6e-f揭示纯胆固醇(F1)更利于T细胞应答，暗示β-谷甾醇可能通过抗炎作用抑制免疫激活。

图7：通过流式分析LNPs在免疫细胞亚群中的递送

F1和F3在DCs中OVA表达最高，且F1显著上调MHC II(MFI增加)，说明胆固醇优化可增强APC成熟和抗原提呈，与T细胞应答结果一致。

研究结论

研究发现，LNPs的组成显著影响circRNA疫苗的递送效率和免疫激活效果。在可电离脂质中，SM-102(pKa=6.7)表现最优，其LNPs在DCs中的转染效率最高，并能有效诱导抗原特异性CD8+ T细胞应答。辅助脂质DOPE比DSPC更有利于内体逃逸和蛋白表达。在甾醇优化中，50%胆固醇+50%β-谷甾醇(F3)的LNPs在体外和体内均表现出最高的蛋白表达水平，但纯胆固醇(F1)配方更有利于T细胞激活，表明β-谷甾醇可能通过抗炎作用抑制免疫应答。最终，SM-102(50%)、胆固醇(38.5%)、DOPE(10%)和DMG-PEG2000(1.5%)组成的LNPs被确定为最优配方，可高效递送circRNA至DCs和淋巴结，并诱导强效T细胞免疫反应。该研究为circRNA疫苗的LNP载体设计提供了关键参数，并提示胆固醇与β-谷甾醇的平衡在疫苗开发中的重要性。