通过胆固醇富集外泌体的膜融合实现siRNA的直接胞质递送

基本信息

英文标题：Direct cytosolic delivery of siRNA via cell membrane fusion using cholesterol-enriched exosomes

中文标题：通过胆固醇富集外泌体的膜融合实现siRNA的直接胞质递送

发表期刊：《Nature Nanotechnology》

影响因子：38.1

作者单位：

中国科学院上海药物研究所

南昌大学江西医学院

浙江大学工程力学系等

作者信息：

Yan Zhuo, Zhen Luo, Zhu Zhu等

研究背景

RNAi治疗的潜力与挑战

RNAi机制：siRNA可通过降解互补mRNA特异性沉默致病基因，在癌症、遗传病等领域具有广阔应用前景。

递送瓶颈：裸siRNA易被血清核酸酶降解，且难以穿透细胞膜，需依赖递送系统(如脂质纳米颗粒LNPs)。

现有递送系统的局限性

内吞途径依赖：LNPs通过内吞进入细胞，但大部分siRNA被困于内体/溶酶体(仅1-4%释放至胞质)。

溶酶体降解：酸性环境和酶导致siRNA失效，且“质子海绵效应”可能引发细胞毒性。

免疫原性风险：合成载体(如阳离子脂质体)可能激活免疫反应，限制长期应用。

外泌体的天然优势与不足

生物相容性：外泌体是内源性囊泡，具有低免疫原性、长循环时间和天然靶向性。

内吞陷阱：天然外泌体仍主要通过内吞途径进入细胞，无法避免溶酶体降解。

膜融合机制的启发

病毒与突触小泡的范例：包膜病毒(如HIV)和神经突触小泡通过膜融合直接释放内容物至胞质，其膜高胆固醇含量是关键。

胆固醇的作用：胆固醇可增加膜流动性、促进局部曲率变化，从而介导融合孔形成。

科学假设

通过工程化增加外泌体膜胆固醇含量，可能将其内化途径从内吞转向膜融合，实现siRNA的高效胞质递送，同时保留外泌体的生物安全性。

研究方法

1. 分子动力学模拟(Molecular Dynamics, MD)

模型构建：

采用粗粒化分子动力学(CGMD)模拟，使用GROMACS 2021.3软件和Martini力场。

构建不同胆固醇含量(0%-30%)的外泌体膜模型，主要成分为DOPC、DOPE、DPSM和胆固醇。模拟外泌体与多组分细胞膜的相互作用，分析膜变形、接触面积和融合能量。

关键参数：

计算径向分布函数(RDF)评估脂质迁移和膜融合倾向。分析自由能曲线(PMF)，量化胆固醇对DOPC分子释放的促进作用。

2. 外泌体工程化

外泌体提取：

从牛奶中提取天然外泌体(MEs)，通过甲基-β-环糊精(MeβCD)去除胆固醇或薄膜水合法增加胆固醇，制备胆固醇含量为5%-30%的MEs。

物理化学表征：

粒径与电位：动态光散射(DLS)测定 hydrodynamic直径和Zeta电位。

形貌与膜厚度：透射电镜(TEM)和冷冻电镜(cryo-TEM)观察杯状结构变化;原子力显微镜(AFM)测定膜弹性(Young模量)。

蛋白组成：Western blot检测标志物(CD63、TSG101、Alix);蛋白质组学分析膜融合相关蛋白(如SNAP、VAMP)。

3. 细胞摄取机制验证

共聚焦显微镜(CLSM)：

用DiO(绿色)标记细胞膜，DiI(红色)标记MEs，实时观察30%Chol/MEs与细胞膜的融合过程。

荧光共振能量转移(FRET)：

标记MEs膜脂质(NBD-PE/Rho-PE)，通过荧光强度变化计算融合效率(57.8%)。

抑制剂实验：

分别用氯丙嗪(clathrin抑制剂)、filipin(caveolin抑制剂)和amiloride(巨胞饮抑制剂)预处理细胞，验证摄取途径依赖性。

4. 基因沉默与抗肿瘤效果评估

体外实验：

siRNA负载：通过电穿孔将siPLK1(靶向Polo样激酶1)载入MEs，测定包封率(EE≈75%)和载药量(LC≈4%)。

基因沉默：RT-qPCR和Western blot检测PLK1 mRNA(84.1%下调)和蛋白表达抑制(60%)。

细胞凋亡：Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞术分析凋亡率(29.2% vs. 对照19.0%)。

体内实验：

皮下瘤模型：HCT116细胞接种BALB/c裸鼠，静脉注射30%Chol/MEs/siPLK1(0.1 mg/kg)，每3天一次，21天后肿瘤体积减少7.3倍。

原位瘤模型：HCT116-LUC细胞植入盲肠，口服给药14天，活体成像显示肿瘤转移抑制。

安全性：血清生化(ALT/AST)和炎症因子(TNF-α/IL-6)检测证实无显著毒性。

5. 统计学分析

数据以均值±标准差表示，GraphPad Prism 8.0进行单因素方差分析(ANOVA)，*P < 0.05为显著差异。

实验结果

图1：胆固醇浓度对外泌体与细胞膜相互作用影响的CGMD模拟

图(a)由DOPC、DOPE和DPSM组成的外泌体分子结构表示，不同胆固醇含量下外泌体膜厚度随胆固醇浓度增加而增大。

图(b)描述外泌体与细胞膜相互作用的快照，显示基于胆固醇含量浓度的二元性：0%和11%胆固醇的外泌体中的内吞作用，以及较高胆固醇浓度(23%和30%)下的融合。

图(c)0.1μs、0.5 μs和1.0 μs下DOPC的RDF图，显示0%和11%胆固醇外泌体中的结构完整性，以及较高胆固醇下的分散分布，说明MEs向细胞膜融合的趋势。

图(d)30%胆固醇外泌体与细胞膜融合的详细可视化，从初始孔形成(0.2 μs)到融合(1.0 μs)的过程跟踪。

图(e)自由能分析表明，胆固醇含量较高的外显子释放DOPC分子所需的能量比不含胆固醇的外显子少。

图(f)DOPC和胆固醇分子穿过POPC细胞膜的自由能变化，显示胆固醇比DOPC更容易穿过细胞膜。

图(g)快照展示了含有30%胆固醇的外泌体与复杂细胞膜在恒定低张力(0 bar)和恒定高张力(4 bar)下的融合过程。

图(h)轨迹图展示了随着表面张力从0 bar逐渐增加到4 bar，融合过程的变化。这些可视化图像表明，无论细胞膜的表面张力如何，融合倾向都是一致的。复杂细胞膜中的胆固醇以白色表示，所有其他脂质分子以绿色表示。

图(i)外泌体与多组分细胞膜之间的相互作用能，表明较高的张力促进融合。胆固醇以红色杆状显示在外泌体内，白色杆状显示在细胞膜内。DOPC(黄色)、DOPE(杏色)、DPSM(橙色)、POPC(绿色)和POPE(青色)以杆状显示其疏水尾部，而只有DOPC和POPC以珠状显示其亲水头部。

图2：不同胆固醇掺入量的MEs表征

图(a)示意图表示不同胆固醇掺入量的MEs制备过程。通过MeβCD或胆固醇处理MEs，分别降低了或增加了膜中的胆固醇含量。

图(b)通过Amplex Red胆固醇测定法检测的ME膜中的胆固醇含量(n = 3次独立实验)。

图(c)不同MEs的水动力直径和ζ电位(n = 3次独立实验)。

图(d)不同MEs的透射电子显微镜图像。比例尺，100 nm。

图(e)流体条件下不同MEs的原子力显微镜图像。比例尺，400 nm。

图(f)通过原子力显微镜测量的不同MEs的杨氏模量值(n = 6次独立实验)。

图(g)不同ME的冷冻透射电镜图像。比例尺，25纳米。

图(h)不同ME的膜厚度(n = 8个重复)。

图(i)ME的蛋白质组学分析。鉴定出的蛋白质根据其细胞成分分类。

图(j)参与膜融合的ME中蛋白质的内容和类别。所有数值均表示为平均值±标准差。统计显著性通过普通单因素方差分析结合多重比较确定。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001.

图3：不同胆固醇水平的MEs通过不同的内化途径进入细胞

图(a)CLSM图像显示了DiO标记的细胞膜与DiI标记的MEs在HCT116细胞中的相互作用。细胞核，蓝色;细胞膜，绿色;MEs，红色。比例尺，25 μm。

图(b)高智能和高灵敏度结构照明显微镜(HIS-SIM)捕捉到的工程化MEs进入HCT116细胞的快照。白色箭头表示内吞的MEs。洋红色箭头表示MEs与细胞膜的融合。DiO标记的细胞膜，绿色;DiI标记的MEs，红色。比例尺，5 μm。

图(c)在不同内吞抑制剂存在下，HCT116细胞对工程化MEs的相对摄取量。氯丙嗪(CPZ，网格蛋白介导)、菲利平(FLP，洞蛋白介导)和阿米洛利(巨胞饮介导的内吞作用)(n=3个生物学独立样本)。

图(d)示意图展示了FRET检测法监测HCT116细胞与脂质染料标记的MEs之间的膜融合。

图(e)融合改变了荧光供体NBD和荧光受体罗丹明在激发波长(Ex)为460 nm时的发射波长(Em，范围从535 nm到580 nm)强度。绘制的曲线表示染料标记的MEs与未标记的HCT116细胞之间的融合。

图(f)MEs与HCT116细胞之间的融合效率(n = 3个生物学独立样本)。

图(g)代表性生物透射电镜图像显示了金纳米颗粒标记的MEs-细胞摄取中间体。轮廓线显示了MEs(红色)和细胞膜(洋红色)，由腔内灰度分布定义。黄色箭头表示金纳米颗粒。比例尺，200 nm。

图(h)来自转染EGFP标记Rab5Q79L的HCT116细胞的代表性CLSM图像。细胞与DiI标记的MEs孵育2小时。细胞核，蓝色;早期胞内体，绿色;MEs，红色。比例尺，5 μm。

图(i)经罗丹明B负载的MEs处理后HCT116细胞的3D重建共聚焦显微镜图像。细胞核，蓝色;细胞膜，绿色;罗丹明B，红色。所有数值均表示为平均值±标准差。统计显著性通过c和f中的单因素方差分析并进行多重比较确定。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001，NS，不显著。

图4：负载SiPLK1的MEs在体外有效抑制了HCT116细胞的生长

图(a)CLSM图像显示了Cy3-siRNA负载的工程化MEs与溶酶体和内质网的共定位。比例尺，15 μm。

图(b–d)通过RT-qPCR检测PLK1 mRNA水平(b)，通过western印迹检测PLK1蛋白表达(c)以及使用CCK-8试剂盒分析细胞活力(d) (n = 3个生物学独立样本)。

图(e，f)通过流式细胞术检查(e)和定量分析(f)HCT116细胞凋亡(n = 3个生物学独立样本)。图(g)通过流式细胞术检测HCT116细胞的细胞周期。所有数值均表示为平均值±标准差。统计显著性在b–d和f中使用普通单因素方差分析并进行多重比较确定。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001，NS，不显著。

图5：负载siPLK1的MEs有效根除皮下HCT116结直肠肿瘤小鼠

图(a)体内治疗方案及分组。BALB/c裸鼠于−7天时皮下(s.c.)接种HCT116细胞(每只小鼠2×10^6个细胞)，并每隔3天通过尾静脉(i.v.)给予工程化MEs(siPLK1浓度为100μg/kg−1)，持续21天。九组：PBS;裸鼠siPLK1;siPLK1/电穿孔;含5%胆固醇的MEs、18%胆固醇的MEs和30%胆固醇的MEs;载有siRNA的MEs，包括5%胆固醇/siPLK1(参见G1)、18%胆固醇/siPLK1(参见G2)和30%胆固醇/siPLK1(参见G3)。

图(b)治疗期间记录的HCT116肿瘤小鼠体重(n = 5个生物学独立样本)。

图(c)实验结束时分离肿瘤组织的重量(n = 5个生物学独立样本)。

图(d)实验结束时分离肿瘤组织的光学图像。

图(e)治疗期间记录的单个肿瘤生长曲线(n = 5个生物学独立样本)。

图(f)结肠肿瘤切片的H&E染色。比例尺，100 μm。

图(g)结肠肿瘤切片的TUNEL染色。比例尺，25 μm。所有数值均表示为平均值±标准差。统计显著性通过普通单因素方差分析并进行多重比较确定。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001，NS，不显著。

图6：负载siPLK1的MEs有效抑制原位HCT116结直肠肿瘤小鼠

图(a)体内治疗方案及分组。BALB/c裸鼠在−10天时被接种了HCT116-LUC细胞(每只小鼠3×10^6个细胞)，并每天通过口服给予工程化MEs(siPLK1浓度为100μg/kg−1)，持续14天。五组：PBS;G0，LNP/siPLK1;G1,5%胆固醇/siPLK1;G2,18%胆固醇/siPLK1;G3,30%胆固醇/siPLK1。

图(b)治疗期间记录的肿瘤小鼠体重(n = 5个生物学独立样本)。

图(c)指定时间点的原位结直肠肿瘤代表性体内生物发光成像。

图(d)通过量化生物发光获得的肿瘤生长曲线(n = 5个生物学独立样本)。

图(e)肿瘤结节数量(n = 5个生物学独立样本)。

图(f)不同器官的代表性体外照片(上图)和生物发光成像(下图)。

图(g)结肠肿瘤切片的H&E染色。比例尺，100 μm。所有数值均表示为平均值±标准差。统计显著性通过普通单因素方差分析并进行多重比较来确定，见b、d和e。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001，NS，不显著。

研究结论

胆固醇调控外泌体摄取途径的机制突破

首次证实通过调节外泌体膜胆固醇含量(23%-30%)可将其内化途径从传统内吞转变为膜融合，实现siRNA直接胞质递送。分子动力学模拟揭示胆固醇通过降低膜融合能量屏障(ΔG减少125 kJ/mol)、促进脂质交换和稳定融合孔，使递送效率提升5.3倍。

高效低毒的基因沉默效果

体外实验：30%Chol/MEs/siPLK1显著抑制PLK1表达(mRNA下调84.1%，蛋白60%)，诱导癌细胞凋亡率(29.2%)优于商业化转染试剂(Lipofectamine 2000)。

体内实验：在结直肠癌模型中，静脉注射使肿瘤体积缩小7.3倍，口服给药有效抑制原位瘤转移，且无肝肾毒性或免疫反应。

递送系统的普适性与临床转化潜力

广谱适用性：机制验证涵盖多种外泌体(牛奶、生姜来源)及癌细胞(HCT116、HepG2等)，但对正常细胞仍保持内吞途径，体现选择性。

双递送策略：突破核酸药物口服递送瓶颈，为胃肠道疾病治疗提供新方案。

平台扩展性：该技术可适配其他核酸药物(如mRNA、CRISPR)，推动个性化基因治疗发展。

理论-实践闭环验证

从分子模拟预测→体外机制解析→体内疗效验证，完整阐释"胆固醇含量-膜融合效率-基因沉默效果"的量化关系，为外泌体工程化提供设计标准。

核心贡献：

创建了一种通过天然膜成分(胆固醇)调控外泌体生物学行为的新范式，解决了RNAi治疗中溶酶体逃逸和递送效率低的关键难题，兼具科学创新性与临床转化价值。