发光追踪+细胞陷阱！科学家破解阿尔茨海默病「毒性蛋白」传播之谜​

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。

NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：A Sensitive and Versatile Cell-Based Assay Combines Luminescence and Trapping Approaches to Monitor Unconventional Protein Secretion

中文标题：一种结合发光与捕获方法的灵敏多功能细胞检测法用于监测非常规蛋白质分泌

发表期刊：《Traffic》

影响因子：3.6

作者单位：

1.Institute of Functional Genomics (IGF), University of Montpellier, CNRS, INSERM, Montpellier, France

2.Department of Biochemistry and Chemistry, School of Agriculture, Biomedicine and Environment, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University, Melbourne, Victoria, Australia

3.Centre de Biologie Structurale (CBS), University of Montpellier, CNRS, INSERM, Montpellier, France

作者信息：

Morgane Denus, Aurore Filaquier, William Fargues, Eloise Néel

研究背景

非常规蛋白质分泌(UcPS)是细胞分泌蛋白质的重要非经典途径，但其机制尚不明确。传统检测方法(如Western blot、ELISA)灵敏度低且操作复杂，无法满足动态监测需求。本文开发了一种基于分裂荧光素酶(NanoLuc Binary Technology)和RUSH(Retention Using Selective Hooks)系统的细胞检测法，用于高灵敏度、高通量分析UcPS，并探索其在神经退行性疾病(如阿尔茨海默病、ALS)中的应用。

研究方法

研究团队开发了一种基于分裂荧光素酶(NanoLuc Binary Technology)和RUSH(Retention Using Selective Hooks)系统的新型细胞检测方法。首先，在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中稳定表达带有HiBit和SBP标签的多种蛋白质(包括经典分泌蛋白TNFα及UcPS相关蛋白如FGF2、Tau、α-突触核蛋白等)。通过分裂荧光素酶互补技术，实时监测细胞内和分泌至培养基中的蛋白量，结合时间动力学分析分泌效率。利用RUSH系统，通过靶向特定细胞器的钩蛋白(如ER定位的Strep-KDEL或胞质暴露的Strep-Ii)结合生物素释放策略，研究UcPS蛋白的运输路径。此外，通过siRNA筛选阿尔茨海默病风险基因，分析其对Tau分泌的影响，并验证Aβ肽对Tau分泌的调控作用。

实验结果

图1：基于分裂荧光素酶的UcPS检测系统构建与验证

通过构建HiBit标签的UcPS相关蛋白(Tau、FGF2、IL1β等)和对照蛋白(GFP)，验证了检测系统的特异性与灵敏度。Western blot显示所有蛋白正确表达且分子量符合预期(如Tau-HiBit-SBP约70 kDa)。荧光素酶活性检测表明，经典分泌蛋白TNFα在12小时内分泌效率达282%，而UcPS蛋白分泌效率显著较低(如Tau为5.3%)。时间动力学实验显示，所有UcPS蛋白的分泌量随时间线性增加，而GFP无分泌信号，且细胞毒性指标LDH释放稳定，排除细胞裂解干扰。该结果证实了系统的高灵敏度(信噪比>100倍)和特异性，为后续研究奠定基础。

图2：UcPS分泌独立于ER-Golgi通路并与囊泡释放相关

通过药物抑制(BFA)和基因敲低(SCFD1 siRNA)阻断ER-Golgi通路，证实TNFα分泌被显著抑制，而UcPS蛋白(如FGF2、Tau)分泌不受影响，表明其不依赖经典分泌途径。进一步使用洗涤剂Digitonin处理培养基，发现Tau、α-突触核蛋白和SOD1的分泌部分依赖于囊泡结构(囊泡占比11%-23%)，而TNFα、FGF2和IL1β则以游离形式分泌。囊泡分泌抑制剂GW4869选择性抑制Tau等蛋白的囊泡释放，证明UcPS存在多途径分泌机制。此外，SOD1突变体(G93A)因诱导细胞凋亡导致LDH释放增加，提示需区分特异性分泌与非特异性泄漏。

图3：RUSH系统揭示UcPS的细胞器依赖性

利用RUSH系统，将UcPS蛋白与靶向ER腔内的Strep-KDEL钩或胞质暴露的Strep-Ii钩结合，研究其分泌路径。结果显示，Strep-KDEL钩有效捕获经典分泌蛋白TNFα，而Strep-Ii钩抑制UcPS蛋白(如FGF2、Tau)的分泌，表明后者依赖胞质暴露的运输机制。IL1β的分泌部分受Strep-KDEL钩抑制，提示其可能通过ER-Golgi中间区室(ERGIC)的TMED10通道(THU通路)分泌。此实验揭示了UcPS路径的异质性，并为后续研究不同货物蛋白的运输机制提供了方法学支持。

图4：神经退行性疾病相关突变体对UcPS的调控

通过构建ALS相关SOD1突变体(G93A、A4V等)和Tau磷酸化/截短突变体(E14、Δ421)，分析其分泌特性。结果显示，SOD1-A4V和G93A突变体分泌增加，而D76Y突变分泌减少，与突变对蛋白稳定性和电荷的影响相关。Tau-E14(模拟磷酸化)和Δ421(C端截短)突变显著促进分泌，而P301S突变因诱导细胞凋亡导致非特异性LDH释放。Western blot证实突变体表达水平差异(如SOD1-G93A表达量降低)，提示分泌变化可能与蛋白稳定性或毒性相关。此部分揭示了疾病突变通过改变UcPS效率影响病理进程的潜在机制。

图5：阿尔茨海默病风险基因筛选及Aβ对Tau分泌的调控

通过siRNA筛选46个阿尔茨海默病风险基因，发现APP加工通路(如PSEN1、BIN1)和内溶酶体相关基因(ABCA7、SORL1)敲低显著抑制Tau分泌，而VCP敲低促进分泌。机制研究表明，外源性Aβ肽被内吞后定位于溶酶体，并通过溶酶体应激诱导Tau分泌，而对照肽无此效应。LDH检测排除细胞毒性干扰，证实Aβ特异性调控Tau分泌。此结果揭示了Aβ与Tau病理的协同作用，为阿尔茨海默病的级联病理模型提供了实验依据。

研究结论

该研究成功建立了一种高灵敏度、高通量的UcPS检测平台，证明UcPS分泌独立于经典ER-Golgi通路，并揭示疾病相关突变(如SOD1-A4V、Tau-E14)显著改变蛋白分泌效率。研究发现，Tau和SOD1等病理蛋白可通过溶酶体分泌途径释放，且Aβ肽通过内吞-溶酶体应激促进Tau分泌，揭示了阿尔茨海默病中Aβ与Tau传播的功能关联。此外，靶向基因筛选表明，APP加工通路及内溶酶体相关基因(如BIN1、ABCA7)对Tau分泌具有关键调控作用，为神经退行性疾病的治疗提供了新靶点。