无需BSL-4！尼帕病毒研究重大突破：微型基因组复制子揭秘液-液相分离，抗病毒药物筛选效率翻倍

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Construction of Minigenome Replicon of Nipah Virus and Investigation of Biological Activity

中文标题：尼帕病毒微型基因组复制子的构建及其生物学活性研究

发表期刊：《Viruses》

影响因子：10.5

作者单位：

1.Guangzhou National Laboratory, Guangzhou 510530, China

2.GMU-GIBH Joint School of Life Science, Guangzhou Medical University, Guangzhou 511436, China

3.Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071, China

作者信息：

Fan Wang, Ruyi Chen, Jiayi Zhong

研究背景

尼帕病毒(NiV)是一种致死率高达40-70%的高致病性人畜共患病毒，但由于其需在生物安全四级(BSL-4)实验室操作，研究受限。现有NiV微型基因组复制子存在功能验证不足、药物敏感性低等问题。本研究旨在开发一种基于荧光素酶(Fluc)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的NiV微型基因组复制子系统，以在BSL-2条件下模拟病毒复制机制，并探究其生物学活性(如包涵体形成机制)和抗病毒药物筛选应用。

研究方法

本研究通过以下实验体系开展：质粒构建方面，设计基于T7启动子的NiV微型基因组，包含N基因5'UTR、报告基因(Fluc/EGFP)及L基因3'UTR，并构建辅助质粒表达N、P(通过P2A自剪切肽串联)和L蛋白;细胞转染采用vTF7-3感染的A549、U251、Vero等细胞系，通过脂质体介导质粒共转染，观察荧光素酶活性及EGFP表达随时间的变化;包涵体(IBs)分析通过共转染N-mCherry和P-EGFP标记质粒，结合荧光漂白恢复(FRAP)、活细胞成像及1,6-己二醇处理，探究IBs的液态-液态相分离(LLPS)特性;RNA干扰设计靶向5'UTR和3'UTR的siRNA，通过RT-qPCR检测mRNA和病毒RNA(vRNA)水平变化;药物与干扰素敏感性测试中，使用阿兹夫定、瑞德西韦、莫努匹拉韦及I/II/III型干扰素处理细胞，通过荧光活性检测和RNA定量评估抗病毒效果;结构域功能验证通过截短N/P蛋白突变体共转染，结合荧光共聚焦显微镜分析IB形成的关键结构域。所有数据通过GraphPad Prism进行统计学分析，实验重复至少三次以确保结果可靠性。

实验结果

图1：NiV微型基因组复制子的构建与验证

通过设计包含T7启动子、N基因5'UTR、报告基因(Fluc/EGFP)、L基因3'UTR及核酶的微型基因组，结合辅助质粒(N/P/L)在vTF7-3感染的A549细胞中实现病毒RNA的复制与转录。实验显示，三质粒(N/P+L)和四质粒(N+P+L)系统的转录效率无显著差异，简化了转染流程;荧光素酶活性和EGFP表达随时间递增，验证了复制子功能(图1D-E)，为后续研究奠定基础。

图2：LLPS驱动IBs的形成

共表达N-mCherry和P-EGFP蛋白可诱导A549、U251和Vero细胞中IBs的形成，FRAP实验显示IBs内蛋白快速恢复(图2A)，活细胞成像捕捉到IBs的液态融合过程(图2D)，证实其LLPS特性。1,6-己二醇(1,6-HD)处理未破坏IBs(图2E)，表明其形成不依赖疏水作用，而可能由多价相互作用介导。

图3：N和P蛋白结构域对IBs形成的贡献

通过截断突变分析发现，N蛋白的C端核心结构域(N-Core)及P蛋白的N0、XD和IDR1结构域缺失会完全抑制IBs形成(图3B-D)，而P-XD缺失在A549细胞中导致IBs形态异常，提示宿主因子可能影响P-XD的功能。该结果揭示了IBs组装的关键分子基础。

图4：RNA干扰对复制子的抑制作用

siRNA靶向5'UTR(si90)和3'UTR(si128)显著降低Fluc活性和EGFP表达(图4B-C)，并减少mRNA水平(图4D)，但vRNA未受影响(图4E)，表明病毒核糖核蛋白复合物(vRNP)对vRNA具有保护作用，为基于UTR的靶向治疗提供了依据。

图5：干扰素抑制病毒复制

I/II/III型干扰素(IFN-α、IFN-γ、IFN-λ)以剂量依赖性方式抑制Fluc活性和EGFP表达(图5A-B)，同时降低mRNA和vRNA水平(图5C-D)，验证了干扰素通路对NiV复制的广泛抗病毒效应。

图6：抗病毒药物评估

阿兹夫定、瑞德西韦和莫努匹拉韦对NiV复制子均表现出抑制作用，其中阿兹夫定效力最强(EC50=0.42 μM)(图6A)，且其作用不破坏IBs结构(图S2)，提示其靶向RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)。该结果为临床抗病毒药物筛选提供了高效工具。

研究结论

本研究成功构建了基于荧光素酶(Fluc)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的尼帕病毒(NiV)微型基因组复制子系统，可在生物安全二级(BSL-2)条件下模拟病毒复制和转录过程，并通过共表达N、P和L蛋白验证其功能性。实验发现，NiV复制子能够形成与活病毒感染相似的细胞质包涵体(IBs)，并通过荧光漂白恢复(FRAP)和活细胞成像证实其动态液态特性，首次揭示IBs的组装由液态-液态相分离(LLPS)驱动。进一步通过截断突变分析发现，N蛋白的C端核心结构域及P蛋白的N0、XD结构域和内在无序区(IDR1)是IB形成的必要结构基础。此外，靶向病毒5'和3'非翻译区(UTR)的siRNA可显著抑制复制子活性，验证了UTR在病毒RNA调控中的关键作用。研究还表明，I/II/III型干扰素(IFN-α、IFN-γ、IFN-λ)及核苷类似物药物(瑞德西韦、阿兹夫定、莫努匹拉韦)均能剂量依赖性抑制复制子活性，其中阿兹夫定的半数有效浓度(EC50)最低(0.42 μM)，且其作用机制不干扰IBs的形成，提示其通过抑制病毒RNA合成发挥抗病毒效果。该研究为NiV的复制机制研究和药物开发提供了安全高效的平台。