双模态成像锁定干细胞最佳注射途径，瘤周注射效果碾压传统方案​

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Quantification of the Engraftment Status of Mesenchymal Stem Cells in Glioma Using Dual-Modality Magnetic Resonance Imaging and Bioluminescence Imaging

中文标题：间充质干细胞在胶质瘤中定植状态的MRI/生物发光双模态成像定量研究

发表期刊：《Academic Radiology》

影响因子：3.8

作者单位：

1.Department of Radiology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Malignant Tumor Epigenetics and Gene Regulation, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University, No. 107 Yanjiang Road West, Guangzhou 510120, China

2.Guangdong Basic Research Center of Excellence for Functional Molecular Engineering, Sun Yat-Sen University, No. 135 Xingang Road West, Guangzhou 510275, China

作者信息：

Minghui Cao, Yunhua Li, Yingmei Tang

研究背景

恶性胶质瘤是最常见的原发性颅内恶性肿瘤，传统治疗手段(手术、放化疗等)的5年生存率仅约36%，亟需创新疗法。间充质干细胞(MSCs)因其肿瘤趋向性成为递送治疗药物的理想载体，但其在胶质瘤中的定植状态(如迁移效率、滞留时间)受给药途径影响显著。既往研究缺乏对MSCs定植状态的实时定量分析，且现有成像技术(如MRI)在细胞数量定量方面存在局限性。本研究通过构建同时表达铁蛋白重链(FTH)和荧光素酶(FLUC)的基因工程MSCs，结合高分辨率MRI定位与高灵敏度BLI定量，系统性评估经不同途径(瘤周、瘤内、动脉内、静脉内)注射后MSCs的定植动态，旨在确定最优给药策略，为MSCs治疗胶质瘤提供实验依据。

研究方法

1. 细胞处理：构建FTH-FLUC双报告基因的MSCs，验证铁存储能力与荧光素酶活性。

2. 动物模型：Wistar大鼠颅内C6胶质瘤模型。

3. 给药途径：瘤周、瘤内、动脉内、静脉内注射FTH-FLUC-MSCs。

4. 成像监测：通过MRI追踪细胞分布，BLI定量细胞数量。

5. 组织学分析：Prussian蓝染色、免疫荧光验证细胞滞留。

实验结果

图1：FTH-FLUC-MSCs的基因表达与铁存储能力验证

图1展示了FTH-FLUC-MSCs的构建及功能验证结果。通过qPCR和Western blot证实，FTH-FLUC-MSCs中FTH和FLUC的mRNA及蛋白表达显著高于对照组(eGFP-MSCs和野生型MSCs)。铁蛋白重链(FTH)的高表达显著提升了细胞的铁存储能力：经铁剂(Ferric Citrate)处理后，FTH-FLUC-MSCs的T2*WI信号显著降低(T2值下降)，原子吸收光谱(AAS)显示其细胞内铁含量高达4.84 pg/细胞，是对照组的3倍以上。普鲁士蓝染色和透射电镜(TEM)进一步显示细胞内铁颗粒的富集。此外，细胞活性、凋亡、迁移及分化实验表明，FTH-FLUC-MSCs的生物学功能未受基因工程影响，证明其安全性。该数据为后续体内成像提供了关键依据，表明FTH-FLUC-MSCs可通过MRI信号变化反映细胞分布，同时保持正常生理功能。

图2：BLI信号强度与FTH-FLUC-MSCs数量的线性相关性验证

图2通过体外实验验证了BLI信号与FTH-FLUC-MSCs数量的定量关系。将不同密度的细胞(1.0×10⁴–1.6×10⁶)与荧光素底物孵育后，BLI信号强度(光子数/秒/mm²)与细胞数量呈高度线性相关(R²=0.98)。野生型MSCs(对照组)无信号，证明FLUC报告基因的特异性。该结果表明，BLI可用于体内实时定量MSCs的存活与分布，且检测灵敏度可达1×10⁴细胞。基于此建立的“细胞数-信号强度”标准曲线为后续体内实验提供了定量基准，使得通过BLI信号反推肿瘤内MSCs定植率成为可能。

图3：FTH-FLUC-MSCs对胶质瘤细胞凋亡及肿瘤生长的影响评估

图3评估了FTH-FLUC-MSCs对C6胶质瘤细胞的体外及体内影响。体外共培养实验中，FTH-FLUC-MSCs与mCherry标记的C6细胞以不同比例(0:1至10:1)共孵育，流式细胞术显示C6细胞凋亡率无显著变化(P>0.05)。体内实验中，通过MRI测量颅内肿瘤体积发现，不同给药途径(瘤周、瘤内、动脉、静脉)的FTH-FLUC-MSCs均未抑制肿瘤生长，与PBS对照组无差异(P>0.05)。该结果证明，本研究中FTH-FLUC-MSCs本身无直接抗肿瘤效应，其作用仅限于作为治疗载体，排除了实验设计中因细胞毒性导致的干扰，突出了后续定植动态分析的客观性。

图4：不同给药途径下FTH-FLUC-MSCs的体内MRI/BLI动态追踪

图4通过MRI和BLI展示了不同给药途径下MSCs的实时分布与迁移。瘤周注射组(PT)在T2*WI上显示肿瘤边缘的低信号区，BLI信号集中于瘤周，随时间向瘤内扩散;瘤内注射组(IT)初期信号集中于瘤核心，后期信号分散;动脉注射组(IA)信号分散且强度弱，静脉组(IV)无信号。BLI显示，PT组信号在第11天仍可检测，而IT和IA组信号在第7天后消失。MRI与BLI结果高度一致，证实瘤周注射可实现MSCs的持续滞留与主动迁移，而静脉注射因肺首过效应几乎无法到达脑部。该动态追踪为优选给药途径提供了直观证据。

图5：不同给药途径的MSCs定植率与滞留时间定量分析

图5通过BLI定量了MSCs的定植率与滞留时间。注射后第1天，瘤周组(PT)和瘤内组(IT)的定植率分别为61%和71%，显著高于动脉组(30%)和静脉组(0%)。随时间推移，PT组定植率缓慢下降(第11天保留6%)，而IT和IA组细胞快速清除(第11天无信号)。T2*WI低信号体积与BLI信号强度变化趋势一致，表明瘤周注射的MSCs在肿瘤微环境中存活更久。该数据明确提示，瘤周注射能实现更高的初期定植率和长期滞留，是MSCs治疗胶质瘤的最优选择。

图6：组织学验证MSCs的肿瘤内分布与滞留

图6通过免疫荧光(eGFP)和普鲁士蓝染色验证了MSCs的分布。瘤周组(PT)中，eGFP+细胞在注射后第1天集中于肿瘤边缘，随后向瘤内迁移，第11天仍有18.5%的细胞滞留;瘤内组(IT)和动脉组(IA)的细胞在第6天后显著减少，第11天仅存5%-6%。普鲁士蓝染色显示PT组铁颗粒在肿瘤边缘富集，与MRI低信号区域重合。组织学结果与成像数据一致，证实瘤周注射的MSCs具有更强的肿瘤趋向性和微环境适应性，为其长效滞留提供了细胞学证据，进一步支持其作为临床给药途径的可行性。

研究结论

瘤周与瘤内注射组在注射后第1天胶质瘤内MSCs定植率分别为61%和71%，显著高于动脉内组(30%)和静脉组(0%)。瘤周注射的MSCs定植率随时间缓慢下降，第11天仍有6%滞留，而其他组细胞在第11天完全消失。MRI显示瘤周注射的MSCs逐渐向肿瘤核心迁移，BLI信号强度与细胞数量呈线性相关(R²=0.98)。组织学证实瘤周组MSCs在肿瘤边缘富集并持续存在，且未影响肿瘤生长。研究结果表明，瘤周注射为MSCs治疗胶质瘤的最佳给药途径，兼具高定植效率与长期滞留优势。