改造T细胞变身“记忆战士”：新型病毒载体让免疫疗法长效狙击肿瘤！

同源异体小鼠肿瘤模型是免疫肿瘤学(I/O)研究中不可或缺的临床前模型，但它们对免疫检查点抑制剂(ICIs)的反应有限，这可能是由于它们的固有低免疫原性。为了解决这一问题，研究人员通过将鸡卵清蛋白(OVA)这一高度免疫原性的蛋白质表达到同源异体肿瘤细胞中，开发了新的免疫原性同源异体模型。这些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，显示出比它们的亲本细胞系更慢的肿瘤生长速度，这可能是由于免疫介导的排斥反应。更重要的是，这些OVA表达的模型对ICIs，特别是抗PD-1治疗，表现出更高的敏感性，这表明它们在增强T细胞介导的免疫反应方面具有潜力。此外，通过过继T细胞转移实验，研究人员验证了这些模型中存在肿瘤特异性记忆T细胞。这些结果表明，OVA工具细胞不仅增强了对ICIs的反应，而且为临床前免疫治疗评估提供了新的、具有更高免疫原性的同源异体模型，这对于I/O研究具有重要的意义。

基本信息

英文标题：Adoptively Transferred Tumor-Specific T Cells Stimulated Ex vivo Using Herpes Simplex Virus Amplicons Encoding 4-1BBL Persist in the Host and Show Antitumor Activity In vivo

中文标题：使用编码4-1BBL的单纯疱疹病毒扩增子体外刺激的过继转移肿瘤特异性T细胞在宿主体内持续存在并显示抗肿瘤活性

发表期刊：《Cancer Research》

影响因子：12.5

作者单位：

1.Department of Microbiology and Immunology, University of Miami Miller School of Medicine

2.Biostatistics Department, University of Miami Miller School of Medicine

3.University of Miami Sylvester Comprehensive Cancer Center

作者信息：

Kyung H. Yi, Hovav Nechushtan, William J. Bowers

研究背景

过继性T细胞转移是一种有前景的癌症免疫疗法，但其疗效受限于T细胞在宿主体内的存活和功能持久性。4-1BB(CD137)是T细胞共刺激受体，其配体4-1BBL可显著延长T细胞存活并增强抗肿瘤活性。本研究利用单纯疱疹病毒(HSV)扩增子高效转导肿瘤细胞表达4-1BBL，通过体外刺激肿瘤特异性T细胞(OT-1/GFP)，探索其在过继转移后的体内行为及抗肿瘤效果。HSV扩增子具有广谱细胞转导能力、大基因容量及诱导先天免疫反应的优势。研究假设：4-1BBL刺激的T细胞在体内持续扩增并分化为效应记忆细胞，从而增强抗肿瘤效果。实验以表达卵清蛋白(OVA)的Lewis肺癌(LLC/OVA)为模型，验证该策略的有效性。

研究方法

1. 载体构建与病毒包装：将小鼠4-1BBL cDNA克隆至HSV扩增子载体，通过辅助病毒游离法包装病毒颗粒。

2. 体外T细胞刺激：用HSV.4-1BBL或HSV.B7.1转导的LLC/OVA细胞(经丝裂霉素C处理)与OT-1/GFP T细胞共培养3-5天，检测增殖及活化标记物(CD44、Ly-6C等)。

3. 过继转移与体内分析：将刺激后的OT-1细胞静脉注射至荷瘤小鼠，通过流式细胞术分析外周血、脾脏及肿瘤中T细胞比例，评估BrdUrd掺入(增殖)及细胞毒性。

4. 抗肿瘤效果评估：测量肿瘤体积，分析生存率及记忆T细胞表型(CD44+Ly-6C+CD62L-)。

实验结果

图1：HSV扩增子介导的4-1BBL/B7.1表达及T细胞体外扩增

本研究首先构建了编码小鼠4-1BBL(HSV.4-1BBL)和人B7.1(HSV.B7.1)的HSV扩增子载体(图1A)，并通过无辅助病毒包装系统实现高效转导。流式检测显示，LLC/OVA肿瘤细胞经HSV.4-1BBL(MOI=1)转导后，4-1BBL表达率显著升高(图1B)，而HSV.LacZ对照组无表达。体外共培养实验中，HSV.4-1BBL转导的肿瘤细胞刺激OVA特异性CD8⁺ OT-1/GFP T细胞，3天后增殖倍数较未转导组提高5倍以上(图1C)，且稀释实验表明即使低至1:32的OT-1初始比例仍可扩增(图1D)。HSV.B7.1组虽诱导增殖，但抗CD28抗体可抑制其效果，提示其依赖CD28信号，而4-1BBL通过独立通路激活T细胞(补充图S1)。此结果验证了HSV扩增子系统在体外高效诱导肿瘤特异性T细胞扩增的能力。

图2：4-1BBL刺激的T细胞活化表型及实验设计

通过流式细胞术分析，HSV.4-1BBL刺激的OT-1细胞高表达CD44(活化标记)、Ly-6C(记忆相关标记)及胞内Granzyme B和膜表面CD107a(细胞毒性标记)，且4-1BB受体表达上调(图2A)。与HSV.B7.1组相比，4-1BBL组Ly-6C⁺细胞比例提高2倍，提示其更倾向于分化为效应记忆亚群。实验设计(图2B)显示，体外扩增3天的OT-1细胞经分选后过继转移至荷瘤小鼠，以评估体内分布、增殖及抗肿瘤效果。表型分析为后续体内实验提供了效应功能的分子基础。

图3：4-1BBL刺激的T细胞体内分布与长期存续

过继转移后第6天，外周血中HSV.4-1BBL组OT-1占比达15.2%，显著高于HSV.B7.1组(3.1%)及未刺激组(1.8%;图3A)。荷瘤小鼠脾脏中，4-1BBL组CD8⁺GFP⁺细胞占比19.8%，而B7.1组仅0.1%(图3B)。非荷瘤小鼠中，4-1BBL组脾脏仍保留7% GFP⁺细胞，表明抗原非依赖存续。肿瘤组织流式显示，4-1BBL组肿瘤浸润OT-1占比8.5%，较未刺激组(1.1%)提高7倍(图3D)。冷冻切片显示脾脏GFP⁺细胞成簇分布(图3C)，提示局部扩增。此结果证实4-1BBL刺激的T细胞在淋巴组织及肿瘤微环境中均具有显著扩增优势。

图4：BrdUrd标记揭示T细胞体内增殖动态

荷瘤小鼠在过继转移后第3、6天注射BrdUrd，第8天分析显示，4-1BBL组肿瘤引流淋巴结(TDLN)中BrdUrd⁺ OT-1占比达32.5%，显著高于未刺激组(4.2%;图4A)。肿瘤组织中，4-1BBL组BrdUrd⁺细胞比例为18.7%，而B7.1组仅2.1%(图4B)。此数据表明，4-1BBL信号不仅促进T细胞迁移至肿瘤部位，还驱动其在TDLN及肿瘤微环境中的持续增殖，可能通过4-1BB-TRAF2-NF-κB通路抑制凋亡并维持克隆扩增。

图5：4-1BBL刺激的T细胞显著抑制肿瘤生长

过继转移2×10⁶个4-1BBL刺激的OT-1细胞后，荷瘤小鼠第14天肿瘤体积较对照组减少85%(P<0.0001;图5A)，且脾细胞对LLC/OVA的杀伤活性提高3倍(图5B)。扩大剂量至4×10⁶个细胞时，88.9%小鼠(8/9)在第30天实现肿瘤完全消退，而对照组均为进展(图5C-D)。Log-linear回归模型显示，4-1BBL组肿瘤生长速率(0.013/day)显著低于未刺激组(0.130/day;P<0.001)。该结果证明4-1BBL刺激的T细胞具备强效抗肿瘤活性，且疗效与细胞剂量及记忆表型相关。

图6：4-1BBL诱导效应记忆T细胞表型

体内存活17天的OT-1细胞中，4-1BBL组CD44⁺Ly-6C⁺CD62L⁻细胞占比达92.3%，显著高于其他组(图6B)。此类表型与效应记忆T细胞(TEM)特征一致，且CD127(IL-7Rα)阴性提示其处于活化终末状态。肿瘤微环境中Ly-6C⁺细胞比例较脾脏高1.5倍(图6A)，可能与局部IFN-γ分泌诱导相关。长期观察(32天)显示脾脏中仍存在9.4%的CD44⁺Ly-6C⁺细胞，证实4-1BBL刺激可诱导长效免疫记忆，为肿瘤复发控制提供可能。

研究结论

体外实验显示，HSV.4-1BBL转导的肿瘤细胞显著促进OT-1细胞增殖并上调CD44、Ly-6C、Granzyme B等效应标记。体内实验中，4-1BBL刺激的T细胞在荷瘤小鼠外周血、脾脏及肿瘤微环境中持久扩增，BrdUrd标记证实其持续增殖。与对照组相比，接受4-1BBL刺激T细胞的小鼠肿瘤体积显著缩小(P<0.001)，88.9%小鼠实现肿瘤消退。记忆表型分析显示，存活T细胞为CD44⁺Ly-6C⁺CD62L⁻效应记忆亚群，且脾细胞对LLC/OVA的杀伤活性显著增强。相比之下，B7.1刺激的T细胞未显示类似效果，提示4-1BBL特异性调控T细胞存活与功能。