生物发光探针问世！4小时精准揪出食品甲醛，守护餐桌安全

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：A new bioluminescent probe for detecting formaldehyde in real food samples

中文标题：一种用于检测真实食品样本中甲醛的新型生物发光探针

发表期刊：《SPECTROCHIM ACTA A》

影响因子：4.3

作者单位：

1.Department of Pharmaceutical Engineering, College of Food and Bioengineering, Xihua University

2.Sichuan Engineering Research Center for Molecular Targeted Diagnostic & Therapeutic Drugs, Xihua University

作者信息：

Ziyao Chen, Jie Zhong, Zhangyan Zhu

研究背景

甲醛(FA)是一种高反应性羰基化合物，常被非法添加至食品(如海鲜、肉类、蔬菜)中以延长保质期，但其过量摄入会导致DNA交联、蛋白质异常修饰等危害，甚至引发呼吸系统疾病、神经退行性疾病等。传统检测方法(如乙酰丙酮分光光度法、HPLC)操作复杂且选择性低，荧光探针存在光漂白和组织穿透性差等问题。生物发光(BL)成像因无需激发光、背景噪声低等优势成为新兴检测手段。本研究首次设计基于萤火虫D-荧光素(Fluc)的生物发光探针FA-Fluc，通过aza-Cope重排反应实现甲醛的特异性检测，并应用于食品和活体成像。

研究方法

1. 探针合成：通过三步反应合成FA-Fluc，包括碱性亲核取代、L-半胱氨酸反应及酸性水解。

2. 选择性测试：测试探针对多种离子、活性羰基化合物(RCS)及生物分子的响应，验证其特异性。

3. 灵敏度与时间依赖实验：通过不同浓度甲醛(10 μM–1 mM)和反应时间(0.5–6 h)评估探针性能，检测限为0.047 ppm。

4. 细胞与动物实验：利用HEK293-Fluc细胞和小鼠模型，动态监测甲醛诱导的BL信号变化，验证探针的活体适用性。

5. 食品样本检测：检测海鲜、农产品及烹饪过程中甲醛含量，并与乙酰丙酮法和HPLC结果对比。

实验结果

图1：FA-Fluc对甲醛的浓度依赖性响应与反应机制验证

该图系统展示了FA-Fluc探针对不同浓度甲醛(10 μM–1 mM)的响应特性及反应机制。通过生物发光(BL)信号分析发现，随着甲醛浓度增加，BL信号呈线性增强(R²=0.9867)，检测限低至0.047 ppm，表明探针具有高灵敏性。此外，HPLC分析进一步验证了探针的化学反应机制：当FA-Fluc与甲醛反应4小时后，探针通过aza-Cope重排和β-消除作用释放活性D-荧光素，生成与标准D-荧光素一致的色谱峰(图1C)。这一结果不仅证实了探针设计的合理性，还揭示了其快速反应特性(4小时内完成)，优于多数基于aza-Cope重排的传统探针。实验还发现，当甲醛浓度超过1 mM时，BL信号逐渐下降，可能由探针饱和或副反应导致，提示实际应用中需优化检测范围。

图2：活细胞中FA-Fluc的实时动态成像与细胞毒性评估

本研究通过HEK293-Fluc细胞模型评估了FA-Fluc在活体环境中的性能。实验显示，随着甲醛浓度升高(100 μM–2 mM)，BL信号显著增强(图2B)，且信号强度随时间延长(0–60分钟)逐步上升，20分钟时达到峰值(图2A)。加入甲醛清除剂NaHSO₃后，BL信号被显著抑制，表明探针对甲醛的特异性响应。MTT实验进一步验证了探针的生物相容性：在10 μM浓度下，HEK293细胞存活率超过90%，即使高浓度(100 μM)下仍保持约80%的存活率(图2C)。这些结果表明，FA-Fluc不仅适用于动态监测细胞内的甲醛水平，且具有低毒性，为活细胞成像提供了安全可靠的工具。

图3：海鲜样本中甲醛的检测与回收率分析

为验证探针在复杂食品基质中的实用性，研究选取虾、带鱼、蛤蜊和鱿鱼圈等海鲜样本进行检测。结果显示，新鲜样本中均检出微量甲醛(如蛤蜊和鱿鱼圈含量较高)，可能与环境污染或代谢产物有关(图3B)。通过加标实验(0、5、10 μM甲醛)，探针的回收率介于78.58%–116.55%，表明其在复杂食品基质中具有较高准确性。进一步通过HPLC对比分析，探针检测结果与传统方法一致(如蛤蜊中甲醛含量为1.90±0.08 μM)，验证了其可靠性(图S4)。该实验不仅证实了FA-Fluc在食品安全检测中的潜力，还揭示了部分市售海鲜中甲醛残留的风险。

图4：农产品与烹饪过程中甲醛含量的变化分析

针对农产品及烹饪过程，研究测试了红辣椒、洋葱、鱼腥草及加工食品(罐头火腿和鱼)。正常样本中甲醛含量可忽略，而污染样本的BL信号与加标量(1 mM甲醛)高度吻合(图4B)。烹饪实验发现，水煮处理显著降低鱼中甲醛含量(可能因甲醛溶于水)，而罐头火腿经油炸后甲醛含量上升(图4D)，推测与Strecker降解(糖类或氨基酸高温分解)有关。这一结果表明，烹饪方式对食品甲醛含量具有显著影响，需结合探针检测优化食品加工流程，以减少有害物质生成。

图5：小鼠体内甲醛的实时生物发光成像

通过BALB/c小鼠模型，FA-Fluc成功实现了活体内甲醛的动态监测。实验组小鼠注射甲醛后，皮下移植的HEK293-Fluc细胞区域BL信号在20分钟达峰值，随后逐渐衰减(图5B中排)，表明探针在活体内快速响应并代谢。而对照组(仅注射探针)和NaHSO₃预处理组信号显著减弱(图5B上、下排)，进一步验证了探针的特异性。此外，未检测到HEK293细胞自身产生明显BL信号(图S5)，排除了背景干扰。该实验证实FA-Fluc具备深组织穿透能力和实时成像潜力，为甲醛的体内代谢研究提供了新工具。

研究结论

FA-Fluc通过aza-Cope重排和β-消除反应实现甲醛的快速响应(4 h内完成)，检测限低至0.047 ppm，且对常见干扰物表现出高选择性。探针成功应用于海鲜、农产品及烹饪过程(如油炸、水煮)的甲醛检测，结果与传统方法一致。此外，活细胞和小鼠实验证明其能实时动态成像甲醛分布，BL信号在20分钟达峰值后逐渐衰减。该探针在食品安全和生物医学领域具有广泛应用潜力。