无毒高亮！新型荧光素配方让活体脑部追踪“看得更久、更清楚”

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。

NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：An optimized luciferin formulation for NanoLuc-based in vivo bioluminescence imaging

中文标题：基于NanoLuc的体内生物发光成像优化荧光素配方研究

发表期刊：《Scientific Reports》

影响因子：3.8

作者单位：

1.Promega Corporation, San Luis Obispo, CA, USA

2.Department of Bioengineering, Stanford University, Stanford, CA, USA

3.Promega Corporation, Madison, WI, USA

作者信息：Chao Gao, Yan Wu, Connor Fitzgerald

研究背景

生物发光成像(BLI)因其非侵入性、高灵敏度和低成本被广泛用于临床前研究，但现有海洋型荧光素(如coelenterazine衍生物)存在溶解度低、毒性高和脑部渗透性差等问题。NanoLuc是一种高亮度的海洋荧光素酶，但其底物furimazine(Fz)类似物在体内应用中受限于溶解度和安全性。本研究旨在优化NanoLuc底物配方，通过改进底物结构(设计新型CFz9)和筛选缓冲液体系，提升底物的溶解性、稳定性及生物相容性，同时降低辅料Poloxamer-407(P-407)的毒性，以实现高效、安全的体内生物发光成像，尤其针对脑部应用。

研究方法

1. 底物设计与合成：合成氟化衍生物CFz9，通过LC-MS和紫外吸收法比较其与CFz的溶解度差异。

2. 缓冲液筛选：测试水、生理盐水、Tris(不同pH)等10种缓冲液对CFz9/P-407复溶后稳定性(溶解度和纯度)的影响。

3. 毒性评估：通过小鼠体重监测、血液生化指标(胆固醇、甘油三酯)和器官组织病理学分析，评价高剂量CFz9(4.2 µmol)及辅料P-407的毒性。

4. 体内BLI验证：在转基因小鼠(肝脏和脑部表达Antares荧光素酶)中对比CFz9与FFz的成像亮度及稳定性，分析复溶后时间对信号强度的影响。

实验结果

图1：氟化修饰显著增强CFz9的溶解性能

通过化学结构改造，CFz9在苯环C8位引入氟原子(图1a)，其溶解度在PBS中较CFz提升3倍以上(图1b)。紫外吸收法(850 nm)显示，CFz9在无辅料条件下的临界溶解浓度为1.5 mM，而CFz仅0.5 mM即出现沉淀。这一改进使得CFz9在高剂量(4.2 µmol)注射时辅料P-407用量从20 mg降至12 mg，降低了毒性风险。此外，CFz9在脑部的摩尔亮度与CFz相当，支持其作为替代底物的可行性。

图2：Tris(pH 8.0)缓冲液实现CFz9复溶后长效稳定

通过LC-MS分析10种缓冲液对CFz9/P-407复溶后稳定性的影响(图2a-c)。结果显示，DPBS(pH 7.0)和碳酸氢盐缓冲液(pH 9.0)导致CFz9快速降解(6小时后纯度<80%)，而Tris(pH 8.0)缓冲液在6小时内维持溶解度和纯度>90%。进一步延长至10小时，仍有70%底物保持溶解状态(图S1)。该缓冲液的弱碱性可能抑制氧化反应，为体内注射提供了稳定的时间窗口(推荐复溶后6小时内使用)。

图3：高剂量CFz9连续注射未引发器官损伤

C57BL/6小鼠连续3天注射高剂量CFz9(4.2 µmol)后，体重波动<5%(图3a)，血液生化显示总胆固醇和甘油三酯短暂升高(表S1)，但组织病理学分析(心、肝、肾、脑)未发现结构性损伤(图3b)。相比之下，传统CFz配方曾导致肝脏巨噬细胞囊泡积累。结果表明，CFz9通过减少辅料用量和优化缓冲体系，显著提升了生物相容性，适用于重复给药的长时程研究。

图4：CFz9在脑部与肝脏成像中媲美商业底物FFz

在表达Antares荧光素酶的转基因小鼠中，CFz9与FFz的峰值信号强度无显著差异(图4a-b)，但CFz9信号衰减稍快(半衰期缩短15%)。脑部成像实验显示，复溶后6小时内的CFz9信号强度保持稳定(图4c-d)，24小时后降至25%。该结果表明，CFz9在脑渗透性和信号持久性上达到应用要求，且成本可能低于商业化的FFz，为NanoLuc系统提供了高性价比的替代方案。

研究结论

1. 底物优化：CFz9的溶解度较CFz提升3倍，辅料P-407用量减少40%，且Tris(pH 8.0)缓冲液可维持复溶后6小时内稳定性(纯度>90%)。

2. 安全性提升：高剂量CFz9(4.2 µmol)连续注射3天未引发器官损伤，仅短暂性血脂升高，毒性显著低于传统配方。

3. 成像性能：CFz9在脑部和肝脏的峰值亮度与FFz相当，且复溶后6小时内信号无衰减，支持其在长时程研究中的应用。

4. 应用价值：优化配方为NanoLuc系统提供了更安全、高效的体内成像工具，尤其在脑部动态监测和药物递送研究中潜力显著。