猪肝细胞成功感染HBV！科学家改造关键受体，催生首个免疫健全动物模型

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：Identification of amino acids restricting HBV receptor function in porcine NTCP

中文标题：鉴定猪NTCP中限制HBV受体功能的氨基酸

发表期刊：《npj Viruses》

影响因子：6.8

作者单位：

1.Institute of Virology, Technical University of Munich/Helmholtz Munich

2.German Center for Infection Research (DZIF), Munich partner site

3.Oregon National Primate Research Center, Oregon Health & Science University

作者信息：Samuel D. Jeske, Jochen M. Wettengel, Florian Gegenfurtner

研究背景

乙型肝炎病毒(HBV)感染全球约2.54亿人，每年导致110万死亡，但目前仍缺乏根治疗法。HBV的天然宿主仅限于人类和类人猿，现有动物模型(如免疫缺陷小鼠或黑猩猩)因伦理或生理差异受限，无法满足免疫疗法研究需求。HBV通过钠牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)进入肝细胞，但猪NTCP(pNTCP)无法介导HBV结合。本研究旨在鉴定pNTCP中限制HBV感染的氨基酸位点，通过人源化改造构建功能性受体，为开发免疫健全的转基因猪模型奠定基础，助力新型疗法评估。

研究方法

1. 肝细胞分离与感染：通过胶原酶灌注法分离原代猪肝细胞(PPH)，接种HBV后检测HBeAg，验证感染能力。

2. NTCP克隆与突变：克隆pNTCP基因，逐步替换人源序列(157-167位氨基酸)，构建嵌合体phNTCP。

3. 荧光结合实验：使用荧光标记的PreS1肽段(Myrcludex B)检测NTCP与HBV的结合能力。

4. 稳定细胞系构建：利用PiggyBac转座子系统生成稳定表达hNTCP、pNTCP及嵌合体phNTCP的HepG2细胞系。

5. 感染效率评估：通过HBeAg分泌、Southern blot检测cccDNA及定量PCR分析病毒复制。

6.毒性测试：评估高剂量嵌合体NTCP对小鼠体重、血液生化指标及器官组织的影响。

实验结果

图1：人源NTCP突破猪肝细胞的HBV感染屏障

通过腺病毒载体在猪肝细胞中表达hNTCP后，HBV感染效率显著提升(图1D)，HBeAg分泌量接近人肝癌细胞HepG2(图1A)。未转导hNTCP的天然猪肝细胞无法检测到HBeAg(图1A)，且荧光标记的Myrcludex B结合实验显示pNTCP无法介导HBV结合(图1F)。此结果证实pNTCP缺乏HBV受体功能，而hNTCP的表达可完全解除这一限制，为后续人源化改造提供依据。

图2：157-167位氨基酸决定HBV受体功能

通过逐步替换pNTCP序列(图2A)，发现人源化外显子2(含157-167位氨基酸)的嵌合体phNTCP可支持HBV感染(图2B)。进一步单点突变筛选(图2C)锁定S158G和P167L为关键位点(图2D)，其突变使HBeAg分泌量接近hNTCP水平。荧光结合实验(图S3)证实这两个突变显著提升Myrcludex B结合能力，表明其直接参与HBV与受体的相互作用。

图3：稳定表达phNTCP的肝细胞实现HBV持续感染

构建稳定表达phNTCP(157-167)及双突变体(S158G/P167L)的HepG2细胞系，荧光显微镜显示Myrcludex B结合位于细胞膜(图3B)，证实受体正确定位。HBV感染后，HBeAg分泌量虽低于hNTCP组，但显著高于未突变pNTCP(图3C)。Southern blot检测到cccDNA(图4C)，证明phNTCP可支持完整病毒复制周期，为转基因动物模型提供直接证据。

图4：嵌合体NTCP实现猪肝细胞HBV感染与cccDNA形成

腺病毒转导phNTCP(157-167)至原代猪肝细胞后，Myrcludex B结合显著(图4A)，HBeAg分泌及cccDNA检测(图4B-D)证实感染成功。尽管病毒载量低于人源NTCP组，但明确检测到rcDNA和cccDNA(图4C)，表明猪肝细胞可支持HBV复制。此结果为构建转基因猪模型提供了关键实验依据，未来通过优化突变组合或提升受体表达量可进一步增强感染效率。

研究结论

1. 关键氨基酸鉴定：pNTCP的S158G和P167L突变是HBV结合与感染的关键限制位点，人源化后显著提升受体功能。

2. 感染模型突破：表达嵌合体phNTCP(157-167)的猪肝细胞成功支持HBV完整生命周期(包括cccDNA形成)，病毒载量达1×10⁷基因组/毫升。

3. 安全性验证：高剂量phNTCP连续注射未引发小鼠器官损伤，仅短暂性血脂升高，生物相容性良好。

4. 应用前景：通过CRISPR技术构建转基因猪，可开发首个免疫健全的HBV感染模型，助力cccDNA靶向药物和免疫疗法评估。