告别针头!可溶微针贴片3分钟释放纳米疫苗，免疫力飙升不输打针

同源异体小鼠肿瘤模型是免疫肿瘤学(I/O)研究中不可或缺的临床前模型，但它们对免疫检查点抑制剂(ICIs)的反应有限，这可能是由于它们的固有低免疫原性。为了解决这一问题，研究人员通过将鸡卵清蛋白(OVA)这一高度免疫原性的蛋白质表达到同源异体肿瘤细胞中，开发了新的免疫原性同源异体模型。这些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，显示出比它们的亲本细胞系更慢的肿瘤生长速度，这可能是由于免疫介导的排斥反应。更重要的是，这些OVA表达的模型对ICIs，特别是抗PD-1治疗，表现出更高的敏感性，这表明它们在增强T细胞介导的免疫反应方面具有潜力。此外，通过过继T细胞转移实验，研究人员验证了这些模型中存在肿瘤特异性记忆T细胞。这些结果表明，OVA工具细胞不仅增强了对ICIs的反应，而且为临床前免疫治疗评估提供了新的、具有更高免疫原性的同源异体模型，这对于I/O研究具有重要的意义。

基本信息

英文标题：A fast-dissolving microneedle array loaded with chitosan nanoparticles to evoke systemic immune responses in mice

中文标题：一种负载壳聚糖纳米粒的快速溶解微针阵列用于激发小鼠全身免疫反应

发表期刊：《Journal of Materials Chemistry B》

影响因子：6.1

作者单位：

1.West China School of Pharmacy, Sichuan University, Chengdu, China

2.State Key Laboratory of Biotherapy, Sichuan University, Chengdu, China

3.Department of Pharmaceutical Sciences, University of Michigan, Ann Arbor, USA

作者信息：

Zhilin Li, Yingju He, Li Deng

研究背景

传统疫苗注射面临疼痛、需专业人员操作和针头废弃物等问题。微针(MN)阵列作为一种无痛、微创的透皮递送技术，可穿透皮肤角质层将抗原递送至表皮层。然而，蛋白类抗原免疫原性低，需与佐剂共递送以增强免疫应答。本研究提出了一种基于聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的快速溶解微针阵列，针尖负载壳聚糖(CS)纳米粒(NPs)，共包封模型抗原卵清蛋白(OVA)和佐剂CpG寡核苷酸(CpG)。通过静电相互作用形成CS-OVA-CpG纳米复合物，旨在利用CS的正电荷特性促进树突状细胞(DC)的抗原摄取，并通过微针快速溶解实现抗原和佐剂在表皮的靶向释放，最终增强全身免疫应答。

研究方法

纳米粒制备：通过静电相互作用将带负电的OVA和CpG与带正电的CS结合，形成CS-OVA-CpG纳米粒，并通过动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)表征其粒径、电位及形貌。微针阵列制备：将CS-OVA-CpG NPs负载至PVP基质中，通过模具成型并干燥，利用共聚焦显微镜评估抗原在针尖的分布均匀性。体外实验：通过流式细胞术和共聚焦显微镜观察DCs对纳米粒的摄取效率。体内实验：小鼠经微针或皮下注射后，评估淋巴结靶向性、血清抗体水平(IgG、IgG1、IgG2a)及脾细胞增殖与细胞因子分泌(IL-4、IFN-γ)。

实验结果

图1：壳聚糖纳米粒的制备与理化性质

通过静电相互作用将带负电的OVA和CpG与CS结合，形成纳米粒。TEM显示CS-OVA复合物(图1b)和CS-OVA-CpG NPs(图1c)呈球形，平均粒径分别为~415 nm和~257 nm。DLS显示CS-OVA-CpG NPs的Zeta电位为+25.8 mV，表明其带正电荷，有利于与细胞膜相互作用。CpG的包封率高达98.99%，证明CS能高效负载带负电的分子。此结果验证了纳米粒的稳定性和作为疫苗载体的潜力。

图2：微针的形态学与抗原负载均匀性

微针阵列由15×15个金字塔形针尖组成，高度600 μm(图2b-d)。共聚焦显微镜显示Cy5.5标记的OVA(红色)仅分布于针尖(图2f-g)，表明抗原成功定位。通过分层扫描(图S1)和荧光强度定量(图2h-i)，证实抗原在针尖分布均匀，且不同批次间一致性高(p>0.05)。机械性能测试显示负载纳米粒后微针的力学强度未受影响(图S3)，保证了穿刺皮肤的可靠性。

图3：微针的体内溶解与皮肤安全性

微针插入小鼠皮肤后，3分钟内完全溶解(图3a-b)。皮肤组织学显示针尖穿透深度约150 μm(图3d-e)，达到表皮层。皮肤刺激性实验(图3f)显示轻微红肿(第1天)，7天后恢复正常，H&E染色未见明显炎症细胞浸润，表明PVP材料生物相容性良好。此结果验证了微针的快速释放能力和临床安全性。

图4：壳聚糖纳米粒增强树突状细胞摄取

流式细胞术显示，CS-OVA-CpG NPs处理2小时后，DCs的抗原摄取率(93.37%)显著高于游离OVA(38.7%)(图4a-c)。共聚焦图像(图4d)显示纳米粒(红色)集中于细胞质，而游离OVA分布分散。CS的正电荷通过静电吸附促进纳米粒与细胞膜结合，验证了其作为递送载体的优势。

图5：CS纳米粒靶向淋巴结的体内验证

皮下注射或微针给药24小时后，Cy5.5-OVA标记的纳米粒在腹股沟淋巴结(LNs)中荧光强度显著高于游离OVA(图5a-f)。冷冻切片显示纳米粒(红色)在LNs内均匀分布(图S4)，证实其通过淋巴管迁移至LNs。粒径(~257 nm)和正电荷特性使其更易被APCs捕获并转运至LNs，为增强免疫应答奠定基础。

图6：微针递送纳米粒显著增强体液与细胞免疫

微针组与皮下注射组的血清IgG、IgG1、IgG2a水平相当(图6b-d)，且显著高于游离OVA组。脾细胞再刺激后，纳米粒组的IL-4和IFN-γ分泌量(图6e-f)及增殖指数(图6g)均显著提高，表明Th1/Th2平衡免疫激活。此结果证明微针递送纳米粒可替代传统注射，实现高效免疫激活。

研究结论

PVP微针可在3分钟内完全溶解并释放CS-OVA-CpG纳米粒至表皮层。CS纳米粒通过正电荷促进DCs摄取抗原，并靶向淋巴结，显著提高OVA特异性抗体(IgG、IgG1、IgG2a)水平和Th1/Th2免疫应答。微针递送与皮下注射效果相当，但更具便捷性和微创性，为透皮疫苗递送提供了新策略。