低氧肿瘤的免疫密钥被发现！这种蛋白让抗癌疫苗效果翻倍

同源异体小鼠肿瘤模型是免疫肿瘤学(I/O)研究中不可或缺的临床前模型，但它们对免疫检查点抑制剂(ICIs)的反应有限，这可能是由于它们的固有低免疫原性。为了解决这一问题，研究人员通过将鸡卵清蛋白(OVA)这一高度免疫原性的蛋白质表达到同源异体肿瘤细胞中，开发了新的免疫原性同源异体模型。这些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，显示出比它们的亲本细胞系更慢的肿瘤生长速度，这可能是由于免疫介导的排斥反应。更重要的是，这些OVA表达的模型对ICIs，特别是抗PD-1治疗，表现出更高的敏感性，这表明它们在增强T细胞介导的免疫反应方面具有潜力。此外，通过过继T细胞转移实验，研究人员验证了这些模型中存在肿瘤特异性记忆T细胞。这些结果表明，OVA工具细胞不仅增强了对ICIs的反应，而且为临床前免疫治疗评估提供了新的、具有更高免疫原性的同源异体模型，这对于I/O研究具有重要的意义。

基本信息

英文标题：Monomeric annexin A2 is an oxygen-regulated toll-like receptor 2 ligand and adjuvant

中文标题：单体Annexin A2是一种氧调节的Toll样受体2配体及佐剂

发表期刊：《Journal for ImmunoTherapy of Cancer》

影响因子：10.3

作者单位：

1. Department of Neurology, New York-Presbyterian/Weill Cornell Medical Center, 525 East 68th St, room F-610, New York, NY 10065, USA

2. Department of Neurosurgery, Hospital Number 1 of China Medical University, Shenyang, China

3. Department of Pathology, University of Southern California, Los Angeles, CA, USA

作者信息：

Brian M. Andersen, Junzhe Xia, Alan L. Epstein

研究背景

Annexin A2(ANXA2)是一类广泛表达的钙依赖性磷脂结合蛋白，可通过形成单体(ANXA2m)或与S100A10结合形成异源四聚体(ANXA2t)发挥不同功能。既往研究表明，ANXA2t通过TLR4/MyD88通路激活巨噬细胞分泌促炎因子(如IL-6、TNF-α)，但其单体形式的免疫调节功能尚未明确。本研究聚焦于肿瘤微环境中的低氧条件(5% O₂)，发现小鼠胶质瘤细胞(GL261)在低氧条件下显著上调ANXA2m的表达，而在常氧(20% O₂)下几乎不表达。进一步实验表明，ANXA2m通过结合Toll样受体2(TLR2)激活树突状细胞(DC)，增强抗原呈递能力，提示其可能作为危险相关分子模式(DAMP)参与肿瘤免疫调控。这一发现不仅拓展了ANXA2的功能认知，还为开发基于ANXA2m的肿瘤疫苗佐剂提供了理论依据，尤其是在低氧微环境丰富的实体瘤(如胶质母细胞瘤)中具有潜在应用价值。

研究方法

研究通过系统性实验验证ANXA2m的免疫调节机制：首先，将小鼠GL261胶质瘤细胞分别置于5%低氧和20%常氧条件下培养，利用质谱分析和免疫印迹技术筛选差异表达蛋白，鉴定出ANXA2m在低氧条件下显著上调。随后，通过免疫共沉淀(Co-IP)和HEK-Blue TLR2/TLR4报告细胞系实验，证实ANXA2m直接结合TLR2并激活下游信号通路(如NF-κB)，而四聚体ANXA2t仅通过TLR4发挥作用。为评估ANXA2m对抗原呈递细胞的影响，研究从小鼠骨髓中分离培养树突状细胞(BMDC)，并检测ANXA2m处理后共刺激分子(CD80/CD86)及细胞因子(IL-12p70、TNF-α)的表达变化;同时，通过OVA抗原脉冲实验结合流式细胞术(采用25-D1.16抗体检测SIINFEKL/H-2Kb复合物)验证其交叉呈递能力。体内实验中，TLR2+/+和TLR2−/−小鼠分别接种ANXA2m与OVA混合疫苗，通过多肽-多聚体染色和流式分析量化外周血中抗原特异性CD8+ T细胞频率，明确TLR2依赖性。此外，研究合成了包含ANXA2 N端36个氨基酸的融合肽(ANXA2-OVA)及其突变体(如缺失前15个氨基酸的ANXA2ΔN15-OVA)，在HEK-Blue TLR2报告细胞和小鼠模型中验证其TLR2结合及佐剂活性，揭示关键功能结构域。

实验结果

图1：ANXA2m在低氧条件下通过TLR2激活免疫信号

图 1a 显示，低氧(5% O₂)培养的GL261细胞裂解物通过TLR2依赖性途径显著增强抗原特异性CD8+ T细胞的IFN-γ分泌，而常氧(20% O₂)裂解物无此效应。

图 1b 通过免疫印迹证实低氧诱导ANXA2高表达，并通过Co-IP验证ANXA2与TLR2的直接结合。图 1c-e进一步利用HEK-Blue TLR2报告细胞系证明，仅ANXA2m(而非ANXA2t)激活TLR2信号，且热变性或蛋白酶处理破坏其活性，排除脂质污染可能。图 1f通过TLR4−/−小鼠模型，证实ANXA2m的佐剂功能独立于TLR4。这些数据共同表明，ANXA2m是低氧微环境特异性表达的TLR2配体，具有明确的免疫激活功能。

图2：ANXA2m增强DC成熟及抗原特异性T细胞应答

图 2a-b 显示，添加ANXA2m可显著提升DC对OVA抗原的交叉呈递能力(SIINFEKL/H-2Kb复合物表达增加)，且该效应仅在TLR2+/+小鼠中显现。图 2c-d 通过BMDC实验证明，ANXA2m诱导CD80/CD86高表达，并促进IL-12p70和TNF-α分泌，提示其促进DC向Th1型免疫极化。图 2e 在体内模型中，ANXA2m-OVA疫苗使TLR2+/+小鼠的外周抗原特异性CD8+ T细胞频率提升3倍，而TLR2−/−小鼠无响应。图 2f 进一步在人源DC中验证，ANXA2m可增强CMV pp65抗原特异性T细胞的IFN-γ分泌，且仅见于CMV血清阳性个体。这些结果从鼠类到人类模型均证实ANXA2m的跨物种佐剂活性。

图3：ANXA2的N端15个氨基酸是其TLR2结合的关键区域

图 3a 通过TLR2报告细胞实验表明，仅含ANXA2 N端36个氨基酸的肽段(ANXA2-OVA)可激活TLR2信号，而缺失前15个氨基酸的肽段(ANXA2ΔN15-OVA)或序列打乱的对照肽均无活性。图 3b 在体内免疫模型中，ANXA2-OVA肽疫苗显著诱导抗原特异性CD8+ T细胞扩增，而ANXA2ΔN15-OVA与对照组无差异。这一发现不仅定位了ANXA2m的功能结构域，还为设计短肽佐剂(如30个氨基酸的抗原-ANXA2融合肽)提供了直接依据，兼具高效性与临床转化可行性。

研究结论

本研究首次阐明单体ANXA2(ANXA2m)作为低氧微环境特异性免疫佐剂的分子机制：ANXA2m通过直接结合TLR2(非TLR4)激活树突状细胞，上调共刺激分子CD80/CD86的表达，并诱导IL-12p70、TNF-α和IFN-γ分泌，显著增强抗原交叉呈递及CD8+ T细胞应答。关键功能域分析表明，ANXA2的N端15个氨基酸是TLR2结合的核心区域，合成的N端肽段(ANXA2-OVA)可完全模拟全蛋白功能，而截断该区域(ANXA2ΔN15-OVA)则丧失活性。这一发现为开发新型肿瘤疫苗提供了理论依据：ANXA2m或其N端短肽(如30个氨基酸的抗原融合肽)可作为高效佐剂，与肿瘤特异性抗原(如新抗原)结合，设计“通用型”或个性化疫苗;联合其他TLR激动剂(如TLR4配体)可能产生协同效应，尤其适用于胶质瘤等低氧实体瘤的免疫治疗。研究不仅拓展了ANXA2的生物学功能认知，还为临床转化提供了兼具靶向性与可行性的策略。