3 小时出结果！新型 NanoLuc 报告菌株解锁酵母双杂交定量检测新姿势

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。

NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells

中文标题：NanoLuc 荧光素酶作为定量酵母双杂交报告基因

发表期刊：《FEMS Yeast Research》

影响因子：2.4

作者单位：

1.Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, 207 South Martin Jischke Drive, West Lafayette, IN 47907, USA

2.Purdue Institute of Inflammation, Immunology and Infectious Disease, Purdue University, 207 South Martin Jischke Drive, West Lafayette, IN 47907, USA

作者信息：Veronica J. Heintz, Ling Wang, Douglas J. LaCount

研究背景

酵母双杂交(Y2H)技术是鉴定蛋白质 - 蛋白质相互作用(PPI)的常用方法，但传统的营养缺陷型报告基因(如 ADE2、HIS3)存在数据获取时间长(需数天)、依赖主观半定量评估(如菌落生长判断)等问题，易导致假阳性且难以高通量筛选。尽管已有 β- 半乳糖苷酶(lacZ)、绿色荧光蛋白(GFP)等报告基因被开发，但前者操作繁琐(需裂解细胞)，后者依赖特殊设备(如流式细胞仪)，均未广泛普及。NanoLuc 荧光素酶(Nluc)是一种来自深海虾的新型生物发光报告基因，具有亮度高(比萤火虫荧光素酶强 100 倍)、背景低、动态范围大等优势，适合作为快速、客观的 Y2H 报告基因。

研究方法

本研究通过以下步骤开发并验证NanoBiT系统：首先，利用环状置换和TEV蛋白酶切割筛选NanoLuc(Nluc)的拆分位点，确定156-157残基为最佳分割点，产生18 kDa大片段(11S)和1.3 kDa小肽(114)。随后，通过随机突变和定向筛选优化11S的稳定性(如热稳定性提高至54°C)，并设计低亲和力肽114(KD=190 μM)以最小化对靶蛋白相互作用的影响。通过β-内酰胺酶抑制模型(SME1与BLIP结合)验证NanoBiT的准确性，测量KD、kon和koff等参数。在细胞实验中，构建FRB/FKBP、β-arrestin-2/GPCR及BRAF/CRAF等融合蛋白，利用雷帕霉素、GPCR激动剂或激酶抑制剂诱导互作，通过实时发光监测动态过程，并在不同温度(21–37°C)下评估响应速度和信号稳定性。

实验结果

图1：BK100Nano菌株的构建与基因组整合策略

内容：展示通过同源重组将NanoLuc基因替换BK100菌株的GAL2-ADE2位点的过程，包括PCR扩增、抗性标记整合及基因组验证。

图2：不同处理条件下 NanoLuc 发光强度比较及细胞密度相关性分析

A 图：比较未处理细胞(Culture)、培养上清(Sup)、玻璃珠破碎(Beads)、酶解(Zymo)及酶解上清(Z Sup)的发光强度，酶解处理强度最高，但未处理细胞的信号背景比更优。

B 图：阳性对照(ANK1-MESA)的发光强度与细胞密度(OD600)呈强线性相关(R²>0.99)，验证 OD600 可用于信号校准。

图3：梯度稀释及培养时间对 NanoLuc 发光信号的影响

ADRB2(β2-肾上腺素受体)与AVPR2(加压素受体)分别融合NanoBiT，显示β-arrestin-2的互作动力学差异：ADRB2信号在激动剂(异丙肾上腺素)刺激后迅速上升并快速衰减(t1/2≈5分钟)，而AVPR2信号持续稳定(t1/2>30分钟)，符合两类受体的内吞和再循环特性。活细胞成像进一步证实信号的空间分布与内体转运相关。

图4：NanoLuc 发光信号与传统营养缺陷型筛选的互作鉴定一致性

A 图：74 对互作组的发光强度呈双峰分布，高信号组(44 对)对应阳性互作，低信号组(30 对)多为阴性。

B 图：与 HIS3 生长筛选对比，一致性达 91%，差异样本多为弱互作或生长波动，验证新方法的可靠性。

研究结论

BK100Nano 菌株优势：成功构建以 NanoLuc 为报告基因的 Y2H 菌株，可通过 96 孔板快速定量检测蛋白互作，发光信号与细胞密度呈强线性相关(R²>0.99)，无需繁琐细胞裂解步骤。高通量兼容性：优化后的检测方法适用于大规模筛选，发光信号的动态范围显著优于传统营养缺陷型报告基因，可通过设定客观阈值(如阴性对照均值 + 3SD)区分真假阳性。与传统方法的一致性：在 74 对互作组验证中，Nluc 检测与 HIS3 生长筛选的一致性达 91%，差异主要源于弱互作在固体培养基上的生长波动，新方法对弱互作的检测更稳定。