无需光激发！新型JF525配体实现单细胞BRET成像，实时捕捉蛋白动态互作

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。

NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Improved HaloTag Ligand Enables BRET Imaging With NanoLuc

中文标题：改进的HaloTag配体实现基于NanoLuc的BRET成像

发表期刊：《Frontiers in Chemistry》

影响因子：5.2

作者单位：

1. Laboratory for Biomolecular Network Dynamics, Biochemistry, Molecular and Structural Biology Section, Department of Chemistry, KU Leuven, Heverlee, Belgium

2. Chem Tech-Molecular Imaging and Photonics, Department of Chemistry, KU Leuven, Heverlee, Belgium

3. Howard Hughes Medical Institute, Ashburn, VA, United States

作者信息：

Ovia Margaret Thirukkumaran，Congrong Wang，Nnamdi Joseph Asouzu

研究背景

传统FRET技术依赖荧光供体的光激发，可能因光毒性、光漂白或自发荧光干扰实验。BRET技术利用生物发光酶(如NanoLuc)作为供体，无需外部激发光源，但早期基于HaloTag618配体的NanoLuc-BRET系统因供体-受体光谱重叠不足导致效率低，难以实现单细胞成像。本研究旨在筛选更高效的HaloTag配体作为BRET受体。通过评估多种罗丹明类配体(如JF503、JF525等)，发现绿色光谱偏移的配体具有更高的光谱重叠积分(J值)，从而提升能量转移效率，同时需平衡供体信号串扰。最终目标是开发适用于单细胞动态成像的高效BRET系统，并应用于蛋白互作监测(如PKA亚基解离)。

研究方法

研究通过体外和细胞内实验系统评估HaloTag配体的BRET效率：

1. 蛋白表达与纯化：将HaloTag与NanoLuc融合表达于大肠杆菌，纯化后用于体外光谱分析。

2. 光谱分析：测量NanoLuc的发光光谱及配体吸收/荧光光谱，计算重叠积分(J值)和量子产率。

3. 细胞成像：在CHO-K1和NIH3T3细胞中表达融合蛋白，标记不同HaloTag配体，使用分光显微镜同步采集供体(460 nm)和受体(525-618 nm)信号，计算受体/供体信号比(RA/D)。

4. 动态监测：通过添加福司柯林(forskolin)诱导PKA亚基解离，实时记录BRET信号变化。

实验结果

图1：NanoLuc与HaloTag配体的光谱特性及重叠分析

展示NanoLuc的发光光谱(蓝线)与不同HaloTag配体的吸收光谱(虚线)，通过填充区域量化光谱重叠(J值)。JF503和JF525因高重叠积分成为高效受体候选。

图2：活细胞BRET成像中不同配体的受体/供体信号比

CHO-K1细胞中Halo-NanoLuc标记不同配体的成像结果。JF525(RA/D=0.82)信号最强，显著优于红色配体(如Halo618)。

图3：基于BRET的PKA亚基动态解离监测

NIH3T3细胞共表达NanoLuc标记的PKA调控亚基(NL-RS)和HaloTag标记的催化亚基(CS-HT)。福司柯林刺激后，JF525标记的BRET信号(RA/D)快速下降，反映亚基解离，动态响应优于Halo618。

研究结论

通过光谱和细胞成像实验，发现绿色光谱偏移的HaloTag配体(如JF525)因更高的光谱重叠和量子产率，显著提升了BRET效率。JF525的受体信号强度是HaloTag618的6.8倍，且供体串扰影响可控(FD仅11.9%)。单细胞成像显示，JF525标记的PKA亚基在福司柯林刺激下BRET信号快速下降，动态响应优于HaloTag618。该研究证实JF525是NanoLuc-BRET成像的最佳受体，为单细胞水平实时监测分子互作提供了高灵敏度、低光毒性的工具。