肝癌治疗新靶点安全获证！靶向URI1不会加剧乙肝病毒复制

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：Evaluation of the role of unconventional prefoldin RPB5 interactor (URI1) in hepatitis B virus infection

中文标题：非典型prefoldin RPBS相互作用因子(URI1)在乙型肝炎病毒感染中的作用评估

发表期刊：《Virology Journal》

影响因子：4

作者单位：

Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Czech Academy of Sciences, Prague, Czech Republic

作者信息：Karolina Štaflová¹, Aleš Zábranský¹, Iva Pichová¹*

研究背景

乙型肝炎病毒(HBV)感染可导致慢性肝病和肝细胞癌(HCC)。URI1是一种与肝癌发生和转移密切相关的宿主蛋白，既往研究提示其可能通过抑制HBx驱动的转录或降低小鼠模型中的HBV复制，成为HBV的潜在限制因子。然而，这些结论多基于质粒转染或HBx过表达模型，未在感染性病毒模型中验证。URI1的高表达与HBV相关HCC的不良预后相关，但其在HBV感染周期中的具体作用尚不明确。本文旨在通过体外感染模型(HepG2-NTCP细胞和原代人肝细胞)研究URI1沉默或过表达对HBV复制的影响，以明确URI1是否可能成为HBV相关HCC治疗的安全靶点。

研究方法

研究采用两种肝细胞模型：表达NTCP受体的HepG2-NTCP细胞和原代人肝细胞(PHH)。通过siRNA介导的URI1沉默和质粒转染介导的URI1过表达，分别评估URI1对HBV感染的影响。病毒感染后，使用ELISA检测病毒抗原(HBsAg、HBeAg)，RT-qPCR分析总HBV RNA和3.5 kb RNA，并通过Western blot验证URI1和HBC蛋白的表达。实验时间点根据细胞类型设置(HepG2-NTCP：感染后5天;PHH：感染后7天)。此外，通过XTT和CellTiter-Glo实验评估基因操作的细胞毒性，确保实验条件无显著毒性。

实验结果

图1：URI1敲低效率及对HBV感染模型的细胞活性影响

本研究通过siRNA在HepG2-NTCP细胞和原代人肝细胞(PHH)中敲低URI1，验证了基因沉默的效率和细胞活性。实验使用三种商业siRNA(URI1 siRNA 1-3)，转染后48小时通过RT-qPCR和Western blot检测URI1表达。结果显示，所有siRNA在两种细胞模型中均显著降低URI1 mRNA水平(HepG2-NTCP下降40-70%，PHH下降约70%)，且Western blot进一步证实蛋白水平的同步降低(图1B-D)。为排除siRNA毒性对实验结果的影响，采用XTT(HepG2-NTCP)和CellTiter-Glo(PHH)检测细胞活性，结果表明敲低URI1未引起细胞增殖或存活率的显著变化(图S1C-D)。此外，通过免疫荧光检测HBc蛋白证实了HBV感染效率(HepG2-NTCP约20%，PHH约40%)，并验证了感染后URI1敲低的持续性(图1C-D)。这些数据表明，URI1敲低在两种模型中均高效且安全，为后续研究提供了可靠基础。

图2：URI1敲低对HBV抗原分泌的影响

通过ELISA和化学发光免疫分析(CLIA)检测HBsAg和HBeAg分泌水平，评估URI1敲低对HBV复制的影响。在HepG2-NTCP细胞中，URI1敲低后HBsAg和HBeAg的分泌均未发生显著变化(图2A-B)。然而，在PHH中，两种siRNA(URI1 siRNA 2和3)导致HBsAg水平显著下降(降幅约30%)，而URI1 siRNA 1仅引起非显著的20%下降(图2A);HBeAg在所有siRNA处理组中均未受影响(图2B)。这一差异可能反映PHH模型对URI1调控更敏感，或不同siRNA的脱靶效应差异。值得注意的是，HBsAg(病毒表面抗原)的分泌依赖于内质网-高尔基体通路，而HBeAg(病毒核心抗原分泌形式)的释放机制不同，提示URI1可能通过特定通路(如脂代谢或宿主转录调控)轻微影响病毒包装或分泌，但整体作用有限。该结果暗示URI1对HBV抗原分泌的调控具有细胞类型依赖性，且在生理更接近人体的PHH中表现更明显。

图3：URI1敲低对HBV RNA水平的影响

通过RT-qPCR检测总HBV RNA和3.5 kb RNA(前基因组RNA，pgRNA)水平，分析URI1敲低对病毒转录的影响。在HepG2-NTCP细胞中，URI1敲低对总RNA和pgRNA均无显著影响(图3A-B)。在PHH中，URI1 siRNA 1导致总HBV RNA和pgRNA分别下降约30%和25%(统计学显著)，而其他siRNA引起15-20%的非显著下降(图3A-B)。这一结果与HBsAg分泌趋势一致，提示URI1可能通过调控宿主转录因子(如RNA聚合酶II)或表观遗传修饰(如cccDNA染色质状态)间接影响病毒转录。然而，由于效应幅度较小且未在所有siRNA中重复，研究认为URI1并非HBV复制的核心调控因子。此外，PHH中更高的感染效率和更接近体内的代谢环境可能放大了URI1的微弱作用，但不足以改变急性感染进程。

图4：URI1过表达对HBV复制的无显著调控作用

为验证早期研究中URI1抑制HBV复制的结论，本研究在HepG2-NTCP细胞中过表达URI1(含HA标签版本)，并检测其对病毒复制的影响。通过转染pcDNA4 URI1或pCMV5 HA-URI1质粒，URI1 mRNA水平提升约10倍(HA-URI1达20倍)，Western blot显示蛋白过表达持续至感染后第6天(图4B-C)。然而，过表达URI1或HA-URI1后，HBsAg、HBeAg分泌及总HBV RNA、pgRNA水平均未发生显著变化(图4D-E)。这一结果直接反驳了既往研究中URI1通过抑制HBx活性限制病毒复制的假说，并提示早期结论可能因实验模型差异(如HBx过表达或质粒驱动的病毒转录)而产生偏差。本研究强调，在基于感染性病毒的真实复制模型中，URI1对HBV无明显调控作用，支持其作为肝癌治疗靶点的安全性。

研究结论

本文发现，在HepG2-NTCP细胞中，URI1沉默或过表达均未显著影响HBV复制(抗原分泌、RNA水平)。在PHH中，URI1沉默虽导致HBsAg分泌和部分HBV RNA水平轻微下降，但效应有限且未达统计学显著性。这一结果与既往基于质粒或HBx过表达模型的研究结论存在差异，提示URI1对HBV复制的调控可能依赖于实验模型的选择(如cccDNA与质粒的差异)。

研究支持URI1作为HCC治疗靶点的潜力，因其沉默未增强急性HBV感染，但需进一步验证其在慢性感染中的作用。