超级细菌‘泄密’！高通量技术破解金黄色葡萄球菌的‘毒素运输密码

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。

NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：High-throughput functional analysis provides novel insight into type VII secretion in Staphylococcus aureus

中文标题：高通量功能分析为金黄色葡萄球菌VII型分泌系统提供新见解

发表期刊：《Royal Society Publishing》

影响因子：4.7

作者单位(前三位)：

Newcastle University Biosciences Institute, Newcastle University, Newcastle upon Tyne NE2 4HH, UK

作者信息(前三位)：

Yaping Yang, Aaron A. Scott, Holger Kneuper

研究背景

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是医院和社区感染的主要病原体，其毒力与VII型分泌系统(T7SSb)密切相关。T7SSb通过分泌毒素蛋白介导细菌间竞争并促进宿主定植，但其在实验室条件下的低分泌活性限制了深入研究。本研究开发了一种基于NanoLuc二进制技术(NanoBit)的高灵敏度检测方法，用于实时监测T7SSb的分泌活动。通过将NanoLuc小片段(pep86)与T7SSb底物(如EsxA和TspA)融合，结合外源添加大片段(11S)和荧光素底物，实现了分泌过程的高通量定量分析，解决了传统免疫印迹法灵敏度低、操作复杂的问题。

研究方法

研究采用NanoBit技术构建报告系统：将11个氨基酸的pep86标签融合至T7SSb底物EsxA或TspA的C端，通过检测胞外荧光信号反映分泌效率。实验在384孔板中进行高通量分析，评估不同菌株(essC1-essC4变异株)及温度(30°C、34°C、37°C)对分泌的影响。通过基因敲除(如ΔessC)和质粒构建验证辅助蛋白(LapT1、LapT2、SACOL2601)在TspA分泌中的作用，并利用链霉亲和素纯化及凝胶过滤层析(SEC)分析蛋白复合物的形成。

实验结果

图1：基于NanoBit技术的T7SS依赖性EsxA分泌验证

NanoBit技术检测EsxA分泌的原理及验证。通过EsxA-pep86融合蛋白的发光信号验证T7SS依赖性，免疫印迹显示essC突变体胞外EsxA缺失。

图2：384孔板高通量检测优化及T7SS分泌动态分析

高通量检测优化。384孔板中监测COL菌株的EsxA-pep86分泌动态，显示△essC突变体信号显著降低，验证系统灵敏性。

图3：金黄色葡萄球菌T7SS活性的菌株差异与温度调控效应

不同菌株分泌活性比较。essC1型菌株(如RN6390)分泌活跃，而essC3(MRSA252)、essC4(EMRSA15)在37°C无活性，温度降低激活EMRSA15分泌。

图4：TspA毒素分泌机制解析：辅助蛋白复合物的功能鉴定

TspA分泌机制。基因簇分析显示LapT1、LapT2及SACOL2601与TspA共定位，缺失任一基因显著减少TspA-pep86胞外信号，共纯化实验证实蛋白复合物形成。

研究结论

NanoBit系统验证：EsxA-pep86的分泌依赖T7SSb(ΔessC突变体分泌显著降低)，且信号检测无需离心分离，可直接在细胞培养液中完成。

菌株与温度差异：essC1和essC2菌株在37°C下分泌活跃，而essC3(MRSA252)和essC4(EMRSA15)仅在低温(30-34°C)下激活分泌，提示温度通过膜流动性调控T7SSb活性。

TspA分泌机制：发现三个保守辅助蛋白(LapT1、LapT2、SACOL2601)与TspA形成复合物，三者缺失导致分泌效率显著下降，SEC证实其共纯化为四聚体复合物。