建立基于荧光素酶的报告系统以研究人类巨细胞病毒感染、复制特性及抗病毒药物疗效

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Establishment of a Luciferase-Based Reporter System to Study Aspects of Human Cytomegalovirus Infection, Replication Characteristics, and Antiviral Drug Efficacy

中文标题：建立基于荧光素酶的报告系统以研究人类巨细胞病毒感染、复制特性及抗病毒药物疗效

发表期刊：《Pathogens》

影响因子：4.5

作者单位(前三位)：

1. Institute for Clinical and Molecular Virology, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nürnberg (FAU), Germany

2. Institute of Virology, Hannover Medical School (MHH), Germany

3. Immuno-Oncology, Oncology Research, Orion Corporation, Turku, Finland

作者信息(前三位)：Julia Tillmanns, Jintawee Kicuntod, Antonia Ehring

研究背景

人类巨细胞病毒(HCMV)是疱疹病毒科β亚家族成员，广泛分布于全球，可导致免疫缺陷患者(如器官移植受者、新生儿)严重并发症。尽管已有抗病毒药物(如更昔洛韦、来特莫韦)，但耐药性、副作用及有限的治疗靶点仍是挑战。本研究旨在构建一种基于荧光素酶(FLuc)的HCMV TB40重组病毒(TB40-FLuc)，用于定量分析病毒复制动态、宿主细胞适应性及抗病毒药物疗效。TB40株因其广谱细胞适应性(成纤维细胞、上皮细胞等)被选为模型，通过替换非必需基因RL13插入FLuc报告基因，结合荧光素酶的高灵敏检测特性，为病毒复制机制和药物筛选提供新工具。

研究方法

研究通过基因重组技术将FLuc基因插入HCMV TB40株的RL13位点，构建重组病毒TB40-FLuc。利用细菌人工染色体(BAC)技术进行病毒基因组编辑，通过同源重组替换RL13基因，并在hTERT-RPE-1细胞中复感染性病毒。实验采用人原代包皮成纤维细胞(HFFs)和视网膜上皮细胞(ARPE-19)验证病毒复制动力学，通过荧光素酶活性检测、qPCR定量病毒基因组、免疫荧光染色(IE1、UL44、MCP蛋白)及Western blot分析病毒蛋白表达。抗病毒药物评估采用96孔板高通量筛选，结合中性红法检测细胞毒性，验证TB40-FLuc在药物敏感性测试中的适用性。

实验结果

图1：重组HCMV TB40-FLuc的构建

该图展示了通过BAC技术将FLuc表达盒(由MCMV MIEP启动子驱动)插入HCMV TB40株RL13位点的过程。RL13基因因在细胞培养中非必需且易突变失活被选为替换靶点，确保重组病毒稳定性。FLuc的插入位置及启动子设计优化了报告基因的表达效率，同时不影响病毒复制能力。通过腺转染hTERT-RPE-1细胞成功复感染性病毒，验证了重组病毒TB40-FLuc的可行性。

图2：TB40-FLuc感染系统的建立与滴定

实验通过梯度稀释法在HFFs中测定TB40-FLuc的感染效价。结果显示，荧光素酶信号与病毒稀释度呈线性关系(1:200至1:20,000)，且在96孔板中可实现高通量检测。单轮感染(加入MBV抑制病毒扩散)验证了信号特异性，无背景干扰。该图为后续抗病毒药物筛选提供了标准化感染条件。

图3：TB40-FLuc与AD169-WT的复制动力学比较

通过qPCR检测病毒基因组释放量，发现TB40-FLuc的复制启动略晚于AD169-WT，但整体动力学相似。多轮感染中，FLuc信号随病毒稀释度线性增加，而单轮感染信号稳定低水平，表明系统适用于不同复制模式的定量分析。结果支持TB40-FLuc作为临床相关株的可靠性。

图4：病毒蛋白表达的时空特征

免疫荧光染色显示，TB40-FLuc感染的HFFs中IE1(立即早期)蛋白均匀分布于细胞核，UL44(早期)形成典型复制灶，MCP(晚期)则呈现核质分布。蛋白表达时序与野生型一致，证实重组病毒未破坏病毒基因表达调控网络。

图5：病毒蛋白表达的Western blot分析

Western blot显示，TB40-FLuc的IE1、UL44、MCP蛋白表达量与AD169-WT及TB40-WT无显著差异，仅MCP表达稍延迟。进一步验证了重组病毒蛋白合成的正常性，支持其作为替代模型的适用性。

图6：TB40-FLuc与TB40-WT的复制能力对比

qPCR定量显示，两种病毒在HFFs中的基因组释放动力学高度一致(MOI 0.01和0.1)，表明FLuc插入未影响病毒复制效率。数据为TB40-FLuc的生物学等效性提供了直接证据。

图7：抗病毒药物活性评估

通过TB40-FLuc和AD169-GFP平行测试，GCV、MBV、LMV的EC50值在两种系统中高度吻合(如LMV EC50均为6 nM)，验证了FLuc系统在药物筛选中的准确性。结果突显其在高通量药物开发中的潜力。

图8：自荧光化合物及宿主靶向药物的评估

使用TB40-FLuc成功检测了自荧光化合物汞溴红(MBM)的抗病毒活性(EC50≈1.6 μM)，避免了荧光报告系统的干扰。同时，CDK8抑制剂MSC2530818在FLuc系统中表现出纳摩尔级活性(EC50≈2 nM)，证实系统适用于宿主靶向药物研究。

图9：报告系统灵敏度比较

TB40-FLuc的检测灵敏度显著高于TB40-YFP和AD169-GFP(最低MOI分别为0.001 vs. 0.01)。在ARPE-19上皮细胞中虽灵敏度较低，但仍可定量感染信号，支持其跨细胞类型应用的潜力。

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图10：早期感染信号检测

感染后6小时即可检测到FLuc信号(MOI≥0.25)，2天后灵敏度提升至MOI 0.001，表明系统适用于病毒早期复制事件的动态监测，为机制研究提供高时间分辨率工具。

研究结论

TB40-FLuc系统成功实现了对HCMV复制的实时、高灵敏度定量分析。相较于传统荧光蛋白(如GFP/YFP)报告系统，FLuc避免了自荧光化合物(如汞溴红)的干扰，且检测灵敏度显著提升(最低检测MOI低至0.001)。病毒复制动力学与野生型TB40一致，支持IE-E-L蛋白级联表达及子代病毒释放。抗病毒药物测试显示，TB40-FLuc能准确测定GCV、MBV、LMV等药物的EC50值，验证了其在药物筛选中的可靠性。此外，该系统在多种原代细胞(如上皮细胞)中适用，为未来研究HCMV宿主适应性及新型抗病毒策略提供了高效平台。