熊去氧胆酸（UDCA）通过SLC7A11抑制胱氨酸摄取及抗肿瘤机制

基本信息

英文标题：Ursodeoxycholic acid inhibits the uptake of cystine through SLC7A11 and impairs de novo synthesis of glutathione

中文标题：熊去氧胆酸(UDCA)通过SLC7A11抑制胱氨酸摄取及抗肿瘤机制

发表期刊：《Journal of Pharmaceutical Analysis》

影响因子：6.1

作者单位：厦门大学医学院翔安医院癌症研究中心、细胞应激生物学国家重点实验室、健康与医学数据科学国家研究院、厦门大学医学院翔安医院肝胆外科

作者信息：Fu'an Xie;Yujia Niu;Xiaobing Chen;Xu Kong;Guangting Yan;Aobo Zhuang;Xi Li;Lanlan Lian;Dongmei Qin;Quan Zhang;Ruyi Zhang;Kunrong Yang;Xiaogang Xia;Kun Chen;Mengmeng Xiao;Chunkang Yang;Ting Wu;Ye Shen;Chundong Yu;Chenghua Luo;Wengang Li

研究背景

UDCA抑制胱氨酸转运机制：熊去氧胆酸(UDCA)通过直接结合胱氨酸转运蛋白SLC7A11，阻断其介导的胱氨酸摄取功能，导致细胞内胱氨酸水平下降。

谷胱甘肽合成受阻：胱氨酸摄取减少抑制谷胱甘肽(GSH)的从头合成，破坏细胞抗氧化系统，引发活性氧(ROS)累积和线粒体氧化损伤。

抗肿瘤效应验证：

体外实验显示，UDCA(≥125 μg/mL)显著抑制脂肪肉瘤细胞增殖;

同位素示踪([15N2]-胱氨酸、[13C5]-谷氨酰胺)证实UDCA干扰胱氨酸代谢及GSH合成通路。

协同治疗潜力：UDCA可增强铁死亡诱导剂(Erastin、RSL3)、MDM2抑制剂(Nutlin 3a、RG7112)、CDK4抑制剂(Abemaciclib)及谷氨酰胺酶抑制剂(CB839)的抗癌效果。

临床相关性：

腹膜后脂肪肉瘤(RLPS)患者血清中UDCA水平显著低于健康人群;

动物模型证实UDCA通过ROS依赖途径抑制肿瘤生长，且与胱氨酸补充具有拮抗效应。

研究方法

代谢组学分析

样本来源：89例RLPS患者 vs. 健康人血清。

技术平台：LC-MS/MS脂质组学，MetaboAnalyst软件分析。

结果：UDCA是RLPS患者血清中下调最显著的代谢物之一(P<0.01)。

细胞功能实验

CCK-8增殖实验：UDCA处理72小时后，SW872细胞活力下降50%(IC50≈125 μg/mL)。

Seahorse能量代谢分析：UDCA导致线粒体OCR(氧消耗速率)下降30%，ATP生成减少。

动物模型数据

肿瘤体积抑制率：UDCA单药治疗组肿瘤体积减少60%(vs. 对照组，P<0.001)。

生存期延长：联合CB839治疗组小鼠中位生存期延长40%(P<0.01)。

实验结果

图1：腹膜后脂肪肉瘤(RLPS)患者和健康捐赠者血清样本的脂质组学分析

(A) 对健康组和患者组的脂质组学数据进行偏最小二乘判别分析。n = 10每组。N: 正常健康个体;T: 腹膜后去分化脂肪肉瘤患者。

(B) 脂质水平的京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能富集分析。n = 10每组。

(C) 脂质相对丰度的火山图，其中差异表达的脂质用红色(上调)和蓝色(下调)标注。在RLPS患者的血清中观察到UDCA减少。n = 10每组。NSD: 无显著差异。

(D) 使用内标(D4-鹅去氧胆酸)对患者和健康个体中UDCA浓度进行绝对定量。n = 53每组。数据以平均值 ± 标准误差(SEM)表示。***P<0.0001。

(E) 术前和术后期间UDCA的浓度，通过内标(D4-鹅去氧胆酸)测定。n = 10。

(F) 在UDCA(200 mg/kg)处理24小时后，对携带脂肪肉瘤的小鼠中UDCA浓度进行相对定量(Ctrl: 未接种脂肪肉瘤;Rp: 腹膜后接种脂肪肉瘤;Sub: 皮下接种脂肪肉瘤;Sub-Sur: 皮下接种脂肪肉瘤并通过手术切除肉瘤)。n = 3。数据以平均值 ± SEM表示。** *P<0.001;ns: 无显著性。数据使用双尾Student’s t检验进行分析。

图2：UDCA抑制脂肪肉瘤细胞的增殖并增加其对铁死亡的敏感性

(A, B) 在不同浓度的UDCA(400、200、100、50、25、6.25、1.5625、0.39063、0.09766、0.02441、0.00610、0.00153、0.00038、0 mg/mL)处理下，SW872 (A) 和 93T449 (B) 细胞的存活率分析。n = 5。

(C-F) 使用UDCA(200 mg/mL)处理导致SW872 (C, D) 和 93T449 (E, F) 细胞的克隆形成减少。n = 3。数据为平均值 ± 标准差(SD)。***P <0.001。Ctrl: DMSO。

(G, H) 显微镜下获得的SW872细胞在400 mg/mL UDCA处理12小时后的代表性图像，以及200 mg/mL和400 mg/mL UDCA处理12小时后SW872细胞的透射电子显微镜(TEM)图像(G)。93T449细胞的情况相同(H)。N: 细胞核。

(I, M) 在SW872和93T449细胞中，使用UDCA(400 mg/mL)处理后的活性氧(ROS)(DCFH-DA)水平测量。n = 3。数据为平均值 ± SD。*P <0.05, **P <0.01。

(J, N) 在SW872 (J) 和 93T449 (N) 细胞中，使用UDCA(400 mg/mL)处理6小时后的C11-BODIPY荧光流式细胞术分析。

(K, O) 在SW872 (K) 和 93T449 (O) 细胞中，使用UDCA(400 mg/mL)处理后的丙二醛(MDA)水平。n = 3。数据为平均值 ± SD。**P <0.01。

(L, P) 在SW872 (L) 和 93T449 (P) 细胞中，单独使用UDCA或与RSL3(1 mM)和erastin(10 mM)联合使用后的细胞存活率分析。n = 3。数据为平均值 ± SD。** *P <0.001。数据使用双尾Student’s t检验进行分析。

图3：UDCA处理后的SW872细胞的代谢组学分析

(A) 对代谢组数据进行的偏最小二乘判别分析。每组n=3。Ctrl：DMSO。

(B) 火山图展示了对照组和UDCA处理组细胞中差异代谢物的相对丰度，其中上调代谢物用红色标记，下调代谢物用蓝色标记。每组n=3。NSD：无显著差异。

(C, D) 对UDCA处理的SW872细胞中的差异代谢物进行的京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能富集分析。每组n=3。

(E) UDCA处理的SW872细胞中差异代谢物的热图。每组n=3。Ctrl：对照组。

图4：UDCA处理后的SW872细胞的稳定同位素示踪分析

(A) 示意图展示了15N(黄色三角形)从胱氨酸整合到谷胱甘肽(GSH)合成途径的过程。

(B) 在含有[15N2]-胱氨酸的培养基中，UDCA或DMSO处理后3、6、12和24小时细胞内标记胱氨酸(M2)的比值。n=3。数据为均值±SEM。*P <0.05。

(C, D) 在含有[15N2]-胱氨酸的培养基中，UDCA和DMSO处理3、6、12和24小时后，SW872细胞中标记和未标记的GSH和GSSG水平。n=3。数据为均值±SEM。**P <0.01，***P <0.001。

(E, F) 用于计算标记率的GSH水平(每组时间点n=3生物重复)，UDCA组(E)和对照组(F);黑点代表标记程度的中位数，须线代表±SEM。

(G) 在UDCA和DMSO处理6和12小时后，培养基中胱氨酸的相对强度。*P <0.05，***P <0.001。

(H) 示意图展示了13C(黄色圆圈)从谷氨酰胺整合到GSH合成途径和三羧酸(TCA)循环的过程，使用[13C5]-谷氨酰胺。

(I-N) 在含有[13C5]-谷氨酰胺的培养基中，UDCA和DMSO处理3、6和12小时后，SW872细胞中标记和未标记的谷氨酰胺(I)、谷氨酸(J)、GSH(K)和GSSG(L)水平。n=3。数据为均值±SEM。*P <0.05;**P <0.01;***P <0.001。

(M) 在含有[13C5]-谷氨酰胺的培养基中，UDCA或DMSO处理后3、6和12小时，细胞内标记谷氨酸[M5]与谷氨酰胺[M5]的比值。n=3。数据为均值±SEM。**P <0.01，***P <0.001。

(N) 在UDCA和DMSO处理6和12小时后，培养基中谷氨酸的相对强度。

(O, P) 在含有[13C5]-谷氨酰胺的培养基中，UDCA和DMSO处理的SW872细胞中标记和未标记的柠檬酸(O)和异柠檬酸(P)水平。n=3。数据为均值±SEM。*P <0.05;**P <0.01;***P <0.001。

(Q) 示意图展示了[13C2](黄色圆圈)从葡萄糖整合到TCA循环的过程。

(R) 在含有[13C2]-葡萄糖的培养基中，UDCA和DMSO处理的SW872细胞中标记和未标记的代谢物水平。n=3。数据为均值±SEM。***P <0.001。

(S) 示意图展示了[13C2](黄色圆圈)从葡萄糖生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氢(NADPH)的过程。

(T) 核酮糖-5-磷酸(Ru5P)/葡萄糖-6-磷酸(G6P)的比值。n=3。数据为均值±SEM。***P <0.001。

(U, V) 糖酵解和TCA循环通量。箭头表示净相对通量的方向;数字表示净相对通量。使用INCA软件将葡萄糖摄入通量固定在100(V1)稳态。细胞经UDCA处理后，谷氨酰胺进入TCA循环的代谢通量增加(V7)。Glu：谷氨酸;Cys：半胱氨酸;a-KG：α-酮戊二酸;Cit：柠檬酸;Isocit：异柠檬酸;Pyr：丙酮酸;Glc：葡萄糖;Fum：延胡索酸;PEP：磷酸烯醇丙酮酸;AcCoA：乙酰辅酶A;Mal：苹果酸;Suc：琥珀酸。

图5：胱氨酸和CB839对UDCA介导的细胞死亡的影响

(A-D) 在SW872(A, B)和93T449(C, D)细胞中，分别用UDCA(400 mg/mL)、胱氨酸(10 mM)及其组合处理12小时后，分析细胞活力。n=5。数据为均值±标准差(SD)。***P <0.001。Ctrl：二甲基亚砜(DMSO)。

(E, F) 在SW872(E)和93T449(F)细胞中，分别用UDCA(400 mg/mL)、胱氨酸(10 mM)及其组合处理12小时后，分析谷胱甘肽(GSH)水平。n=5。数据为均值±SD。***P <0.001。

(G) 在不同血清浓度的培养基中，用UDCA(400 mg/mL)处理SW872细胞后，分析细胞活力。n=4。数据为均值±SD。*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001;ns：无显著差异。

(H) 在含有胎牛血清(FBS)和透析FBS的培养基中，用UDCA(400 mg/mL)处理SW872细胞后，分析细胞活力。n=3。数据为均值±SD。*P <0.05，***P <0.001;ns：无显著差异。

(I) 在补充FBS或透析FBS的培养基中，用不同浓度的UDCA和胱氨酸处理SW872细胞后，分析细胞活力。n=4。数据为均值±SD。**P <0.01，***P <0.001。

(J) 在SW872和93T449细胞中，分别用UDCA(400 mg/mL)和胱氨酸(10 mM)单独或联合处理12小时后，检测氧消耗率(OCR)。n=3。数据为均值±SEM。

(K, L) 分析单独或联合使用UDCA(250 mg/kg/天)和胱氨酸(1 mmol/kg/天)对SW872细胞皮下成瘤能力的影响。n=7。数据为均值±SD。*P <0.05。

(M-P) 在SW872(M, N)和93T449(O, P)细胞中，分别用UDCA(400 mg/mL)和CB839(50 nM)单独或联合处理12小时后，分析细胞活力。n=5。数据为均值±SD。*P <0.05，**P <0.01，***P <0.0001。

(Q, R) 在SW872(Q)和93T449(R)细胞中，分别用UDCA(400 mg/mL)和CB839(50 nM)单独或联合处理12小时后，检测丙二醛(MDA)水平。n=3。数据为均值±SD。*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001;ns：无显著差异。

(S) 在SW872细胞中，分别用UDCA(400 mg/mL)和CB839(50 nM)单独或联合处理12小时后，检测氧消耗率(OCR)。n=3。数据为均值±SEM。

(T, U) 分析单独或联合使用UDCA(250 mg/kg/天)和CB839(200 mg/kg/天)对SW872细胞皮下成瘤能力的影响。n=5。数据为均值±SD。**P <0.01，***P <0.001。Oligo：寡霉素;FCCP：羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙;Rot/AA：鱼藤酮/抗霉素A。

图6：基于SLC7A11的UDCA结合和转运分析

(A) 在SW872细胞中，分别用UDCA和胱氨酸单独或联合处理12小时后，通过Western blot分析GPX4和SLC7A11的表达。n=3。数据为均值±标准差(SD)。

(B, C) UDCA(B)和胱氨酸(C)与SLC7A11的结合抑制分析。n=3。数据为均值±SEM。*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001;ns：无显著差异。

(D) 使用Schrodinger 2018软件进行分子建模和对接分析，展示野生型SLC7A11及其预测的结合位点。

(E) UDCA和乙二胺生物素(EA-Biotin)偶联化合物(UDCA-Biotin)的化学结构。

(F, G) 在93T449(F)和SW872(G)细胞中，通过免疫共沉淀分析UDCA-Biotin与SLC7A11的相互作用。

(H) 在野生型(空载体)、SLC7A11敲低(SLC7A11 KD)和SLC7A11过表达(SLC7A11 OV)的SW872细胞系中，通过Western blot分析SLC7A11的表达。

(I, J) 在野生型、SLC7A11 KD和SLC7A11 OV细胞系中，用UDCA处理后，细胞内(I)和培养基中(J)UDCA的相对丰度。n=3。数据为均值±SD。*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001;ns：无显著差异。

(K) 在野生型、SLC7A11 KD和SLC7A11 OV细胞系中，用UDCA处理12小时后，评估细胞活力。n=5。数据为均值±SEM。*P <0.05，***P <0.001。

(L-N) 培养基中UDCA(L)、谷氨酸(M)和胱氨酸(N)的相对丰度。n=3。数据为均值±SEM。**P <0.01，***P <0.001;ns：无显著差异。

(O-T) 用UDCA和CB839(1 mM)处理后，细胞和培养基中谷氨酸(O, P)、UDCA(Q, R)和胱氨酸(S, T)的相对丰度。数据为均值±SEM。*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001;ns：无显著差异。Ctrl：DMSO;PTM：预处理;SA：链霉亲和素;Xct：Xct抗体。

图7：SLC7A11在腹膜后脂肪肉瘤(RLPS)临床组织样本中的表达及UDCA增强多种肿瘤细胞对活性氧(ROS)诱导的抑制剂介导的抗肿瘤治疗的敏感性

(A) 使用指定抗体对RLPS组织和邻近脂肪组织微阵列进行免疫组织化学(IHC)染色。n=50。数据为均值±标准差(SD)。*P <0.001。

(B) 通过Western blot检测来自腹膜后去分化脂肪肉瘤和分化良好脂肪肉瘤患者的RLPS和邻近脂肪组织裂解液中的MDM2、CD36和SLC7A11。n=17。

(C, D) 对MDM2(C)和SLC7A11(D)进行的泛癌分析(数据来源：http://www.sangerbox.com/home.html)。

(E-L) 在去分化脂肪肉瘤(SW872)(E)、纤维肉瘤(HT1080)(F)、结直肠癌(HCT116)(G)、乳腺癌(MDA-MB-231)(H)、肝癌(HUH7)(I)、胆管癌(QBC939)(J)、食管癌(KYSE30)(K)和肺癌(A549)(L)细胞中，分别用UDCA(400 mg/mL)、nutlin3a(10 mM)和RG7112(5 mM)单独或联合处理24小时后，分析细胞活力。n=5。数据为均值±SD。P <0.01，***P <0.001;ns：无显著差异。

图8：UDCA抑制SLC7A11介导的胱氨酸摄取并破坏谷胱甘肽(GSH)从头合成的机制示意图

UDCA抑制胱氨酸的细胞内转运，导致细胞内胱氨酸、半胱氨酸和GSH水平降低，进而引发线粒体损伤和三羧酸循环(TCA循环)紊乱。

研究结论

研究背景

对RLPS患者的血清进行脂质组学分析，发现UDCA水平在手术后显著下降并反弹。

UDCA的作用机制

UDCA的功能和机制因癌细胞类型、治疗持续时间、剂量及药物组合而异。

UDCA通过抑制SLC7A11介导的胱氨酸转运，导致GSH合成受损，并增加细胞对ROS的敏感性。

研究意义

揭示了UDCA在肿瘤中的新机制，特别是其通过SLC7A11调控胱氨酸代谢的作用。

为UDCA在抗肿瘤治疗中的应用提供了理论基础。

未来研究方向

研究肿瘤发生与其他胆汁酸(如EDCA)的关系，EDCA在脂肪肉瘤患者血清中也显著下降。