开发靶向NanoLuc的蛋白降解剂及通用报告系统以评估标签靶向降解平台

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。

NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Development of NanoLuc-targeting protein degraders and a universal reporter system to benchmark tag-targeted degradation platforms

中文标题：开发靶向NanoLuc的蛋白降解剂及通用报告系统以评估标签靶向降解平台

发表期刊：《NATURE COMMUNICATIONS》

影响因子：17.694

作者单位：

1. The Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research

2. Department of Medical Biology, University of Melbourne

3. Promega Biosciences LLC

作者信息：

Christoph Grohmann, Charlene M. Magtoto, Joel R. Walker

研究背景

靶向蛋白降解技术(如PROTACs)通过劫持E3泛素连接酶复合物，实现目标蛋白的泛素化及蛋白酶体降解，已成为药物开发和功能研究的重要工具。然而，现有标签靶向降解系统(如FKBP12F36V和HaloTag7)存在局限性：标签插入效率低、降解剂不可逆或催化效率不足。本研究旨在扩展标签靶向降解系统，开发新型催化型NanoLuc靶向降解剂(NanoTACs)，并通过通用报告系统对比不同系统的降解效率。NanoLuc因其小分子量、稳定性及生物发光特性，成为理想标签候选。通过优化降解剂设计，结合CRL4CRBN或CRL2VHL复合物，NanoTACs可高效降解NanoLuc标记的底物，同时利用荧光素酶报告系统实现高通量筛选，为标签选择及降解剂优化提供标准化平台。

研究方法

研究通过构建融合蛋白(如Halo-EGFP-NanoLuc-FKBPF36V和Halo-Firefly-NanoLuc-FKBPF36V)，结合稳定表达的HEK293T和HT29细胞系，评估不同降解剂(如dTAG、HaloPROTAC和NanoTAC)的降解效率。利用Western blot和生物发光检测(NanoLuc/Firefly双报告系统)定量蛋白降解水平，并通过时间梯度实验、抑制剂(如MG132和MLN4924)处理验证降解的蛋白酶体依赖性。此外，通过功能实验(如MLKL介导的坏死性凋亡抑制)评估降解剂的生理相关性。全局蛋白质组学分析确认NanoTACs的特异性，排除脱靶效应。

实验结果

图1：NanoTAC降解系统开发

图1a展示了三种tTPD系统(FKBPF36V、NanoLuc、HaloTag7)的工作原理：标签融合目标蛋白后，双功能降解剂通过连接E3连接酶(CRL4CRBN或CRL2VHL)触发泛素化及蛋白酶体降解。图1b对比各标签特性，NanoLuc因催化降解能力和生物发光优势脱颖而出。图1c-d显示NanoTAC4(NC4)的化学结构，其由NanoLuc抑制剂与CRBN配体(沙利度胺)通过优化链长连接而成，通过劫持CRL4CRBN实现高效降解。此图奠定了NanoTACs的设计框架，强调其作为新型催化降解剂的潜力。

图2：NC4作为高效NanoTAC降解剂的鉴定

通过Halo-Firefly-NanoLuc-FKBPF36V(H-FF-N-F)报告系统，图2b-c显示NC4在低浓度(30 nM)下显著降低Firefly荧光素酶活性及蛋白水平，并呈现典型的“钩状效应”(高浓度抑制降解)。

图2e-f证明NC4可在2小时内快速降解底物，且去除降解剂后24小时内蛋白水平恢复，表明其可逆性。

图2h的蛋白质组学分析显示NC4特异性靶向融合蛋白，无显著脱靶效应。

图2i-j通过蛋白酶体抑制剂(MG132)和NEDD8激活酶抑制剂(MLN4924)验证降解的泛素-蛋白酶体依赖性。这些数据表明NC4是高效、特异的催化型降解剂。

图3：FKBPF36V系统降解效率对比

图3b-c通过Firefly荧光素酶活性比较不同tTPD系统的降解动力学。F36V-CRBN(FC1/FC2)和F36V-VHL(FV1)降解剂在5小时内即可实现90%以上的底物清除，显著优于Halo-VHL(HV1/HV2)和NanoTAC(NC4)。图3d的Western blot进一步验证了FC1和FV1的高效降解能力。图3e显示蛋白酶体抑制剂可完全阻断降解，确认机制一致性。此图凸显FKBPF36V系统在标签靶向降解中的主导地位，尤其FV1在核定位蛋白中表现优异。

图4：F36V-VHL降解剂的优越性

图4a-b通过持续性表达H-E-N-F的细胞系，比较各降解剂的持久性。FV1在48小时内维持近完全降解，且去除降解剂后仍保留长效效果，而NC4和HaloPROTACs降解效果随时间减弱。图4d-f以MLKL-FKBPF36V为模型，显示FV1在1小时内即可清除目标蛋白，并在抑制坏死性凋亡中表现出极低有效浓度(3.9 nM)。此图强调E3连接酶选择(VHL vs. CRBN)及标签位置对降解效率的关键影响，尤其在生理相关模型中。

研究结论

研究发现，FKBPF36V靶向降解系统(如dTAG13和dTAGV-1)在降解效率、最低有效浓度及持久性方面优于HaloTag和NanoLuc系统，尤其F36V-VHL降解剂(FV1)在核定位蛋白(如Fibrillarin)中表现卓越。NanoTACs作为催化型降解剂，可在低纳摩尔浓度下实现快速、可逆的底物降解，但受限于NanoLuc酶活性抑制，需优化以提升适用性。HaloPROTACs因共价结合特性需更高浓度，且降解动力学较慢。通过通用报告系统验证，不同标签和E3连接酶组合的降解效率存在底物依赖性，强调需针对具体蛋白选择最优标签-降解剂对。