支持乙型肝炎病毒结合和感染的NTCP动物同源基因的鉴定

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：Identification of NTCP animal orthologs supporting hepatitis B virus binding and infection

中文标题：支持乙型肝炎病毒结合和感染的NTCP动物同源基因的鉴定

发表期刊：《Journal of Virology》

影响因子：5.4

作者单位(前三个)：

1. Technical University of Munich, Germany

2. German Center for Infection Research (DZIF), Germany

3. Heidelberg University Hospital, Germany

作者信息(前三个)：

Fuwang Chen, Jochen M. Wettengel, Florian Gegenfurtner

研究背景

乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球重大健康威胁，每年导致超过80万人死亡。由于HBV仅自然感染人类和黑猩猩，缺乏合适的动物模型严重阻碍了慢性HBV治疗策略的研发。人源钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(hNTCP)是HBV进入肝细胞的关键受体，但其在物种间的氨基酸序列差异形成了跨物种传播的天然屏障。本研究通过分析多种动物NTCP同源基因的功能，筛选能够支持HBV结合和感染的受体，旨在揭示潜在HBV宿主并推动动物模型开发。研究聚焦于NTCP的物种特异性区域(如157-165位氨基酸)，结合功能实验验证其结合HBV PreS1结构域及介导感染的能力。

研究方法

研究通过以下方法展开：

1. NTCP同源基因筛选与表达载体构建：基于hNTCP的HBV结合域(157-165位氨基酸)序列相似性，从公共数据库获取12种动物NTCP基因，构建带有荧光素酶(Cluc)报告基因的共表达载体。

2. 功能验证：转染HepG2细胞，通过荧光标记的MyrB-PreS1肽段结合实验检测NTCP表面定位;利用放射性标记的牛磺胆酸([³H]-taurocholate)摄取实验评估NTCP的胆汁酸转运功能。

3. HBV感染实验：在表达不同NTCP的HepG2细胞中接种HBV，通过检测HBeAg分泌和HBc蛋白免疫染色评估感染效率。

4. 突变分析：针对结合HBV但无法介导感染的NTCP(如仓鼠、山羊、牛)，通过定点突变(如84-87位氨基酸替换)构建嵌合体，验证其功能恢复。

5. 原代肝细胞验证：分离马和雪貂原代肝细胞，结合RNAscope和qPCR检测HBV进入及复制能力。

实验结果

图1：NTCP同源基因筛选与序列比对

通过比对hNTCP的HBV结合域(157-165位氨基酸)，筛选出12种动物NTCP同源基因。结果显示，G158位在除海豚和猕猴外的物种中高度保守，而157、160、161、164和165位存在显著差异(如猕猴NTCP的G158N突变完全阻断HBV结合)。已知支持HBV感染的树鼩、马NTCP作为阳性对照，小鼠NTCP因84-87位突变无法介导感染。该图揭示了物种间NTCP功能差异的结构基础。

图2：NTCP-Cluc共表达系统的构建与验证

构建Cluc与NTCP的T2A自切割共表达载体，验证其功能：

Western blot显示hNTCP正确切割并表达;

荧光素酶活性间接量化NTCP表达水平;

MyrBatto488结合实验证实hNTCP膜定位;

[³H]-taurocholate摄取实验表明共表达系统保留胆汁酸转运功能;

HBV感染实验显示HBeAg分泌，证明系统可用于高通量筛选。

图3：NTCP同源基因的PreS1结合能力

通过转染HepG2细胞并标记MyrBatto488，发现除海豚和猕猴外，多数NTCP(如马、犀牛、猫)支持PreS1结合，但结合强度差异显著(如马NTCP亲和力高于hNTCP)。结合能力与后续感染效率相关，但仓鼠、山羊和牛NTCP虽能结合却无法介导感染，提示存在感染后步骤限制。

图4：流式细胞术定量PreS1结合能力

利用HA标签标记NTCP，结合流式细胞术双染色(抗HA-Alexa488和MyrBatto565)，定量分析各NTCP的PreS1结合效率。结果显示，鲸NTCP结合能力较弱，而马和犀牛NTCP显著高于hNTCP。该实验验证了结合能力的物种差异，并为后续功能突变研究提供数据支持。

图5：NTCP介导HBV感染的效率评估

通过HBeAg分泌和HBc蛋白免疫染色，确认土拨鼠、雪貂、兔等9种NTCP支持HBV感染，而仓鼠、山羊和牛NTCP无感染活性。感染效率与PreS1结合能力不完全一致，提示NTCP功能域外的因素(如膜融合或核转运)影响感染结局。

图6：嵌合NTCP突变体的功能恢复

针对仓鼠NTCP的84-87位(H84R/P87N)及牛/山羊NTCP的82位(F82V)进行突变，发现嵌合体可恢复HBV感染能力。例如，仓鼠嵌合NTCP的HBeAg分泌水平接近hNTCP，而牛NTCP-F82V突变后感染效率显著提升。该结果明确了NTCP功能域的关键作用，并为跨物种受体改造提供策略。

图7：原代肝细胞的HBV感染验证

分离马原代肝细胞(PHoH)，证实其支持HBV感染(HBeAg、HBsAg及cccDNA阳性)。雪貂原代肝细胞(PFH)虽可结合MyrBatto565并摄入病毒，但无感染迹象，提示其限制因素存在于核衣壳释放或cccDNA形成步骤。RNAscope检测显示PFH中存在HBV rcDNA，进一步支持病毒进入但复制受阻的结论。

研究结论

研究发现，土拨鼠、雪貂、马、兔、鲸等9种动物的NTCP同源基因可支持HBV结合和感染，提示这些物种可能作为潜在HBV宿主或动物模型。仓鼠、山羊和牛的NTCP虽能结合HBV，但需特定氨基酸替换(如仓鼠NTCP的H84R/P87N突变，牛/山羊NTCP的F82V突变)方可介导感染，表明NTCP的84-87位及邻近区域是跨物种感染的关键功能域。此外，雪貂原代肝细胞虽允许HBV进入，但后续复制受阻，提示物种特异性限制可能存在于感染后步骤。该研究为HBV跨物种传播机制提供了新见解，并为动物模型开发及潜在宿主筛查奠定了基础。