利用可吸入的纳米治疗剂对巨噬细胞进行免疫代谢重编程，用于急性肺损伤干预

基本信息

英文标题：Immunometabolic Reprogramming of Macrophages with Inhalable CRISPR/Cas9

Nanotherapeutics for Acute Lung Injury Intervention

中文标题：利用可吸入的CRISPR/Cas9纳米治疗剂对巨噬细胞进行免疫代谢重编程，用于急性肺损伤干预

发表期刊：《Acta Biomaterialia》

影响因子：9.7

作者单位：广州医科大学第五附属医院生物医学工程学院

作者信息：毛成琼研究团队

研究背景

ALI是一种严重的肺部疾病，特点是肺内炎症的突然发生，导致较高的发病率和死亡率。

ALI的病理机制主要与巨噬细胞功能障碍有关，表现为巨噬细胞产生大量促炎因子和趋化因子，加剧肺损伤。

巨噬细胞的代谢过程与它们的功能状态和ALI中的炎症反应密切相关。葡萄糖代谢是能量来源，并在炎症中调节免疫细胞功能。

糖酵解在激活的免疫细胞中上调，为炎症反应提供能量和生物合成中间体。

己糖激酶2(HK2)是调节巨噬细胞代谢和炎症的关键因子，其表达的失调与增强的炎症反应有关。

CRISPR/Cas9系统被设计用来特异性地下调HK2表达，从而调节巨噬细胞的代谢和炎症特征。

吸入递送系统在肺部疾病治疗中具有优势，可以有效输送药物并减少系统性副作用。

纳米载体已被广泛用于疾病治疗，研究者开发了一种气溶胶化的核壳脂质纳米平台(CSNs)来载药并针对肺中的抗原处理细胞。

CSNs被用来封装针对HK2的基于mRNA的CRISPR/Cas9系统，并在体外和体内测试了其基因编辑效率和HK2敲除情况。

研究结果显示，CSN-mCas9/gHK2治疗显著降低了巨噬细胞中的糖酵解和炎症，有助于减轻LPS诱导的ALI小鼠模型的炎症。

研究方法

设计并表征了靶向小鼠HK2基因的CRISPR/Cas9系统，包括合成了gRNA质粒，通过体外转录制备了Cas9 mRNA和Cas9-GFP mRNA，并通过T7核酸内切酶I测定评估了HK2的敲除效率。

利用W/O微乳法合成了钙磷核心与mCas9/gRNA结合的CSN-mCas9/gRNA纳米粒子，并使用Malvern Zetasizer Nano ZS90和透射电子显微镜对其进行了表征。

通过透析评估了mCas9从CSNs中的释放，并检查了纳米粒子的稳定性和pH响应能力。

使用C57BL/6J小鼠作为实验模型，所有动物实验均严格遵守伦理标准，并经华南理工大学动物护理和使用委员会正式批准。

进行了iBMDM细胞的培养和诱导，包括BMDM、BMDC和AMs。

研究了CSNs的体外细胞摄取能力，使用流式细胞术进行了定量分析。

利用Seahorse XF-96 Extracellular Flux Analyzer评估了iBMDM的OCR和ECAR，以及糖酵解和线粒体功能。

利用流式细胞术进行了细胞表面标志物的定量分析。

开发了一种全身暴露系统，用于吸入治疗小鼠，并研究了CSN-mCas9/gHK2在小鼠体内的生物分布和安全性。

建立了LPS诱导的ALI小鼠模型，用于评估CSN-mCas9/gHK2在ALI预防和治疗中的效果，包括评估BALF中的细胞和炎症因子、肺损伤评分、MPO活性和肝功能指标。

使用Prism 9.0软件进行统计分析，所有实验均独立重复三次，以保证结果的可重复性。

实验结果

图1a,b展示了CSNDSPA、CSNDOPS和CSNDOTAP的粒径、多分散指数和表面电荷，通过动态光散射和透射电子显微镜测量。

图1c显示了在10% FBS中pH 7.4条件下CSNs的直径随时间变化。

图1d显示了相同条件下CSNs的多分散指数变化。

图1e显示了BMDMs细胞与CSNs-DIR共培养30分钟后的图像，红色表示CSNs-DIR，绿色表示荧光素-秋李素染色的肌动蛋白纤维，蓝色表示DAPI染色的细胞核。

图1f显示了FACS分析中CSNs-DIR在BMDM、BMDC和AMs中的细胞摄取。

图1g显示了在不同pH水平下随时间间隔累积释放的mRNA数据。

图2：CSN传递的CRISPR/Cas9系统介导的基因破坏。

图2a,b展示了iBMDM细胞中GFP荧光强度和GFP表达细胞百分比。

图2c显示了iBMDM细胞中HK2基因的mRNA水平和蛋白水平，表明CSN-mCas9/gHK2可以有效地下调HK2的表达。

图3：mCas9/gHK2重编程巨噬细胞的葡萄糖代谢。

图3a,b显示了LPS诱导的HK2和GLUT1(Slc2a1)基因表达的变化可以通过CSN-mCas9/gHK2减少。

图3c显示了LPS诱导的iBMDM在CSN-mCas9/gHK2处理后的2-NBDG摄取量，通过FACS检测。

图3d显示了iBMDM在CSN-mCas9/gHK2处理后的代表性ECAR曲线，通过Seahorse XF检测。

图3e-g计算并显示了基础糖酵解、糖酵解能力和糖酵解储备。

图3h-k显示了Seahorse实验中检测到的基础呼吸、最大呼吸和ATP链接呼吸的代表性OCR曲线。

图4：CSN-mCas9/gHK2减弱了LPS诱导的体外炎症。

图4a,b显示了LPS诱导的iBMDM细胞中CD80和CD86双阳性细胞的百分比，通过FACS检测。

图4c-e显示了iBMDM培养基上清液中的IL-1β、TNFα和IL-6等炎症因子的水平，通过ELISA检测。

图4f显示了iBMDM治疗后的STING激活，通过 western blot检测。

图4g显示了iBMDM培养基上清液中的IFN-1β水平，通过ELISA检测。

图4h显示了LPS诱导的iBMDM中一氧化氮的产生量，通过不同的治疗进行检测。

图5：吸入的CSN-mCas9/gRNA靶向肺部的巨噬细胞。

图5a,b显示了在LPS诱导的ALI小鼠肺部吸入CSN-DIR后的主要器官图像，显示荧光仅在肺部。

图5c通过HPLC数据显示了在ALI小鼠肺部吸入后的RhoB标记CSNs在各种组织中的浓度。

图5d显示了FACS对肺部APC亚群的表型鉴定，具体为肺泡巨噬细胞(AMs)和树突状细胞(DCs)。

图5e显示了CSN-DiR吸入后AMs和DCs的比例。

图5f显示了在LPS诱导的ALI小鼠肺部吸入CSN-mCas9/GFP后的荧光图像，仅在肺部发现荧光。

图5g定量评估了这些肺特异性荧光信号。

图6：吸入式CSN-mCas9/gHK2减轻了ALI。

图6a显示了在LPS安装前用三种剂量的CSN-mCas9/gHK2预处理的小鼠，在LPS诱导后的8小时处死。

图6b显示了肺部湿重和干重的比值。

图6c显示了BALF中的总蛋白量。

图6d显示了BALF中的总细胞数。

图6e显示了吸入CSN-mCas9/gHK2

研究结论

1. 成功合成并表征了封装mCas9和gHK2的CSNs，其中CSNDOPS展示了最佳的靶向递送特性。

2. CSN-mCas9/gHK2系统有效地在体外干扰了巨噬细胞中的HK2表达，定量PCR、western blot和surveyor核酸酶测定结果证实。

3. 在炎症条件下，CSN-mCas9/gHK2重编程了巨噬细胞的葡萄糖代谢，并通过代谢组学进一步验证，显示了抑制糖酵解和改变了线粒体功能。

4. 这些发现强调了HK2在免疫细胞代谢和炎症中的关键作用。

5. 在体内，CSN-mCas9/gHK2的气溶胶化递送有效地到达了肺部，并极少分布于全身，显著减轻了LPS诱导的肺水肿、炎症和白细胞浸润。

6. 治疗还使巨噬细胞极化向抗炎表型转变，并减少了BALF中的促炎细胞因子。

7. 本研究展示了CSN-mCas9/gHK2作为ALI的有前途的治疗方法，利用靶向基因编辑调节免疫细胞代谢和炎症。

8. 气溶胶化递送系统增强了其应用于肺病的适用性，提供了局部化、有效且安全的治疗方式。

9. 这种方法对于推进ALI的治疗具有重要的潜力，并对其他炎症性肺病的治疗可能具有影响。