LncRNA MACC1-AS1通过抑制铁死亡诱导胰腺癌细胞对吉西他滨耐药

基本信息

英文标题：LncRNA MACC1-AS1 induces gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells through suppressing ferroptosis

中文标题：LncRNA MACC1-AS1通过抑制铁死亡诱导胰腺癌细胞对吉西他滨耐药

发表期刊：《Cell Death Discovery》

影响因子：7

作者单位：宁波大学第一附属医院肝胆胰外科、福建医科大学、宁波大学医学部等

作者信息：Jiyun Zhu, Zehao Yu, Xuguang Wang, Jinghui Zhang et al.

研究背景

胰腺癌是一种罕见但致死率高的恶性肿瘤。

吉西他滨是胰腺癌的主要化疗药物，但响应率低，易产生抗药性。

铁死亡是一种新的细胞死亡方式，与胰腺癌细胞的抗氧化系统有关。

Nrf2-ARE和Keap1-Nrf2途径在调节铁死亡中起重要作用。

非编码RNA，特别是MACC1-AS1，可能在胰腺癌细胞的抗药性中发挥作用。

MACC1-AS1通过特定途径影响胃癌细胞的行为。

STK33与PDAC细胞的恶性行为和低氧诱导因子-1α有关。

MACC1-AS1/STK33轴可能在胰腺癌的吉西他滨抗药性中起关键作用。

研究评估了抑制MACC1-AS1和STK33在临床治疗中的效果。

临床预测DCA的效果被纳入研究评估。

研究方法

1. 样本来源：来自中国宁波大学医学院第一附属医院的30名胰腺癌患者的胰腺癌组织样本，通过抽签方式选择样本，所有患者均签署了研究同意书，研究方案得到医院伦理委员会的预先批准。

2. 细胞和细胞培养：使用中国科学院细胞库和IMMOCELL购买的人胰腺导管腺癌(PDAC)细胞系，包括PANC-1、MIAPACA、PANC-1/Gem和MIAPACA/Gem，通过短串联重复(STR)标记确认细胞系的真实性，所有细胞均使用DMEM培养基在37°C、5%二氧化碳的环境中培养。

3. 慢病毒和逆转病毒生产和感染：使用针对MACC1-AS1、STK33、Kras的shRNA和siRNA进行基因沉默，并通过慢病毒和逆转病毒载体进行感染。

4. CRISPR/Cas9介导的基因敲除：使用基于CRISPR/Cas9的工具对MACC1-AS1基因进行敲除。

5. 细胞增殖实验：使用CCK8试剂盒评估细胞增殖。

6. 脂质过氧化产物(MDA)和活性氧(ROS)分析：使用试剂盒评估脂质过氧化产物和活性氧水平。

7. 细胞器特异性染色：使用C11-BODIPY、JC-1和脂质-BODIPY进行细胞器特异性染色。

8. RIP和RNA pulldown分析：使用Millipore的Magna RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒和Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit进行RNA结合蛋白的免疫沉淀和RNA pulldown实验。

9. CLIP-qPCR：使用交联免疫沉淀和qPCR试剂盒进行RNA结合蛋白的特异性结合位点的。

10. 亚细胞分离：使用Norgen Biotek Corp的试剂盒进行细胞质和细胞核的分离。

11. FISH和免疫荧光染色：使用lncRNA FISH试剂盒和抗STK33抗体进行荧光原位杂交和免疫荧光染色。

12. 细胞和组织的总RNA提取和定量PCR：使用定量PCR分析细胞和组织中的RNA水平。

13. 蛋白质提取和Western blot分析：使用RIPA缓冲液提取蛋白质，并通过Western blot分析蛋白质表达。

14. 动物和肿瘤模型：使用Balb/c裸鼠建立肿瘤模型，评估肿瘤生长和生存期，动物实验遵守相关伦理规定，并得到大学伦理委员会的批准。

15. 质谱分析：使用Orbitrap-Elite质谱仪进行蛋白组学分析。

16. 生物信息学分析：使用R软件对TCGA和GTEx数据库中的MACC1-AS1和STK33表达数据进行分析。

17. 统计学分析：使用SPSS和GraphPad Prism软件进行统计学分析，P值小于0.05被认为具有统计学意义。

18. 数据可用性：实验数据可在合理请求下从通讯作者处获得。

实验结果

图1：MACC1-AS1在胰腺癌中高度表达，并与吉西他滨耐药性不良预后相关

- A, B：通过TCGA数据分析，MACC1-AS1在PDAC(胰腺导管腺癌)患者中的表达与生存率(OS)的关系。- C：MACC1-AS1在不同PDAC细胞系和正常胰腺细胞中的表达。- D：下调或上调MACC1-AS1基因对PANC-1/Gem和MIAPACA/Gem细胞在吉西他滨(20 uM)处理下的细胞活力的影响。- E, F：MACC1-AS1对肿瘤药物耐药性相关基因(MDR1, GSS, P450 3A4/5, E-cadherin)蛋白水平的影响。

图2：MACC1-AS1直接与STK33相互作用，促进吉西他滨耐药

- A：通过LC-MS/MS分析MACC1-AS1过表达后的下游目标。

- B：通过共沉淀实验验证MACC1-AS1与STK33的结合。

- C：通过RIP实验证明MACC1-AS1与STK33的相互作用。

- D：通过免疫沉淀法证实MACC1-AS1结合蛋白。

- E, F：从预测网站选取MACC1-AS1全长及T1, T2, T3片段进行进一步研究，并通过RNA沉淀和Western blot进行验证。

- G：通过CLIP-qPCR研究T1/T2/T3片段与STK33的结合。

- H：确认MACC1-AS1的T3片段与STK33的相互作用。

- I–K：利用IF和Alphafold数据库展示STK33与MACC1-AS1(T3片段)结合的特定位点和细胞共定位。

图3：MACC1-AS1通过阻止STK33的泛素化和降解，增强其活性

- A：下调MACC1-AS1后STK33的表达量。

- B：通过CRISPR KO工具研究MACC1-AS1 FL或T3片段对STK33的影响。

- C：探索STK33的稳定性，通过下调MACC1-AS1和MG-132处理。

- D：通过CHX处理评估STK3的表达量。

- E：下调MACC1-AS1条件下STK33泛素化水平。

- F–H：研究MDM4与STK33的关系。

- I, J：通过过表达或下调MACC1-AS1及STK33评估STK33的表达量。

- K, L：通过过表达MACC1-AS1和下调STK33，或在两种细胞中上调STK33，评估细胞活力。

图4：MACC1-AS1/STK33通过抑制铁死亡产生吉西他滨耐药

- A：评估在不同的细胞死亡抑制剂存在或不存在条件下，shMACC1-AS1和shSTK33的细胞活力。

- B–G：通过共聚焦激光显微镜捕捉JC-1, 脂质染色, BODIPY C-11, MDA和ROS assay的代表性图像。

- H–J：通过过表达MACC1-AS1, 敲低MACC1-AS1或上调STK33条件下铁死亡抑制蛋白的表达量。

图5：MACC1-AS1/STK33抑制铁死亡中的GPX4降解

- A, B：在PDAC药物抵抗细胞中，通过erastin(30 μM)处理24小时后，下调MACC1-AS1或STK33对STK33和GPX4蛋白水平表达的影响。

- C, D：通过基因转染过表达MACC1-AS1或STK33，在PANC-1和MIAPACA细胞中，处理erastin(30 μM)24小时后对GPX4蛋白表达以及STK33的影响。

- E, F：MACC1-AS1或STK33下调或过表达的PANC1细胞在erastin(25 μM)和 cycloheximide(CHX，25 μg/ml)处理下，设计时间点的Western blot分析结果。

- G, H：过表达GPX4恢复了MACC1-AS1或STK33下调的PDAC药物抵抗细胞在erastin(30 μM)处理24小时后的GPX4表达。

图6：Kras调节MACC1-AS1以维持胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药性

- A：在TCGA数据的PDAC患者队列中，分析MACC1-AS1和Kras表达的相关性。

- B, C：通过过表达Kras或敲低Kras，并伴随siMACC1-AS1在PANC-1细胞中或伴随过表达MACC1-AS1在PANC-1/Gem细胞中，评估MACC1-AS1和Kras的功能。

- D, E：在上述条件下，测量MAD和ROS assays的结果。

- F, G：通过qPCR检测在过表达Kras或敲低Kras细胞中的MACC1-AS1表达。

- H：通过诱导剂Doxycycline(30 ng/ml)诱导过表达Kras表达，并在0, 12, 24, 36小时后检测MACC1-AS1表达的qPCR分析。

图7：MACC1-AS1/STK33信号轴在胰腺癌动物和细胞模型中的潜在应用

- A–D：在动物模型中，通过注射过表达MACC1-AS1的PANC-1细胞和对照细胞，并在第7天给予Gemcitabine，测量肿瘤体积、生存时间、肿瘤照片和肿瘤重量。

- E, F：PANC-1和PANC-1/Gem细胞共转染指定 vectors/MACC1-AS1/si-STKSS/ML281(治疗)和scramble/si-MACC1-AS1/STK33，在不同浓度的Gemcitabine处理后，通过CCK8 assay测量细胞活力。

- G, H：PANC-1和PANC-1/Gem细胞共转染指定 scramble/MACC1-AS1/STKSS 和scramble/si-MACC1-AS1/si-STK33，在不同时间的Gemcitabine处理后，通过CCK8 assay测量细胞活力。

图8：MACC1-AS1/STK33信号轴在胰腺癌患者中的临床预后潜力

- A, B：分别分析TCGA PADC患者中MACC1-AS1, MACC1-AS1+STK33的OS, PFS和DFS。

- C：使用MACC1-AS1和STK33的组合、MACC1-AS1、STK33建立DCA模块，并分析PDAC患者的1年OS时间。

重要图片提示：

- 图5和图6展示了MACC1-AS1/STK33信号轴对铁死亡相关蛋白GPX4的调控作用，这对于理解耐药机制至关重要。

研究结论

1. MACC1-AS1在胰腺癌中高表达，与吉西他滨耐药性相关。

2. MACC1-AS1通过抑制铁死亡，增强胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药性。

3. MACC1-AS1通过与STK33相互作用，抑制其泛素化和降解。

4. MACC1-AS1/STK33信号轴通过激活GPX4，抑制铁死亡。

5. 过表达MACC1-AS1的胰腺癌细胞表现出对吉西他滨的耐药性增强。

6. 下调MACC1-AS1可以恢复胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。

7. MACC1-AS1与STK33的联合检测可预测胰腺癌患者的预后。

8. MACC1-AS1/STK33信号轴是胰腺癌化疗耐药性中的关键因素。