山芝吲哚生物碱抗慢性肾小球肾炎的药理学研究

基本信息

英文标题：Pharmacological investigation of indole alkaloids from Alstonia scholaris against chronic glomerulonephritis

中文标题：山芝吲哚生物碱抗慢性肾小球肾炎的药理学研究

发表期刊：《Phytomedicine》

影响因子：7.9

作者单位：云南大学化学科学与工程学院、昆明植物研究所、云南中医学院中药学

作者信息：Rui Guo，Jian-Hua Shang，Rui-Han Ye，Yun-Li Zhao (通讯作者)，Xiao-Dong Luo (通讯作者).

研究背景

CGN是由自身抗体和免疫复合物侵入肾脏引起的一组疾病，是中国患者终末期肾疾病的主要原因。

肾活检组织病理学检查是诊断CGN的标准方法。

CGN分为原发性肾小球肾炎和继发性肾小球肾炎，其中FSGS是最常见的原发性肾小球肾炎，而advanced glomerulonephritis和lupus nephritis是最常见的继发性肾小球肾炎。

大多数行业认为，人类CGN主要是由免疫球蛋白、补体或两者介导的。

西医对CGN的保守治疗主要使用症状治疗方法，如免疫抑制剂、糖皮质激素和血管紧张素转化酶抑制剂。

植物生物碱广泛用于治疗慢性肾脏疾病，阿ilstonia scholaris是一种含有丰富生物碱的植物，可用于治疗慢性肾小球肾炎。

阿ilstonia scholaris具有现代药理作用，包括抗炎、抗氧化、抗高尿酸血症以及抗呼吸道疾病效应。

本研究旨在通过ADR诱导的动物和细胞模型来确认总生物碱和四种主要生物碱的效果，并进一步探讨其初步机制。

研究方法

文章介绍了实验所需的各种化学试剂和仪器，包括ADR(阿霉素)、DMEM培养基、胎牛血清、MTT、DMSO、RIPA裂解缓冲液、尿蛋白和肌酐试剂盒等。

介绍了植物材料阿ilstonia scholaris的采集地点、鉴定和生物碱的制备方法，包括学者碱、石松碱、瓦莱碱和19-表学者碱的提取和分析。

使用网络药理学方法预测了四种主要生物碱的作用靶点，并通过KEGG和GO分析探讨了其潜在的分子机制。

详细描述了ADR诱导的MPC5细胞损伤模型的建立过程，包括细胞培养、MTT实验、IC50曲线的绘制等。

描述了四种生物碱对ADR诱导的MPC5细胞损伤的保护作用，包括非抑制性浓度的筛选和细胞活力的测量。

介绍了RT-qPCR和Western blotting两种分子生物学方法，用于检测目标基因和蛋白的表达水平。

描述了ROS(活性氧物质)的检测方法，以及流式细胞术在实验中的应用。

介绍了动物实验的部分，包括小鼠的来源、饲养条件、实验分组和给药方式等。

介绍了小鼠体重和尿液的测量方法，以及血清和肾脏组织的收集过程。

描述了肾脏组织的病理染色方法，以及使用双盲法观察病理变化的过程。

最后，介绍了实验数据的统计学分析方法，包括使用GraphPad Prism软件进行数据分析。

实验结果

图1. 网络药理学分析

(A) 交集靶点韦恩图。

(B) 化合物-靶点网络图。

图1 (B)展示了化合物-靶点网络图，图中显示了四种主要生物碱(Val、Epi、Sch、Pic)与慢性肾小球肾炎(CGN)相关靶点的相互作用关系，用于理解化合物可能的作用机制。

图2.

(A) KEGG富集分析。

(B) GO富集分析。

图2展示了KEGG和GO的富集分析结果，有助于了解化合物潜在的生物过程和分子功能。

图3. 化合物-靶点-通路网络

图4. 所选化合物的分子对接模型与目标蛋白结合。

(A) Epi与HRAS的分子对接模式。

(B) Epi与KDR。

(C) Val与CDK2。

(D) Val与HSP90AA1。

(E) Pic与HSP90AA1。

(F) Sch与HRAS。

图5. ADR对MPC5细胞的IC50值

(A) ADR诱导MPC5细胞损伤24小时。

(B) ADR诱导MPC5细胞损伤48小时。

图6. 四种吲哚生物碱对MPC5细胞的细胞活力影响。

(A) 四种生物碱不同浓度(25、50、75、100 μM)对MPC5细胞活力的影响(无ADR，n = 5)。

(B) 四种生物碱对ADR诱导的MPC5细胞损伤的保护作用。与Control组相比，# p < 0.05, ## p < 0.01;与Model组相比，* p < 0.05, ** p < 0.01。

图7. Val和Epi对MPC5细胞中ADR诱导的蛋白表达的影响

细胞在无ADR或含ADR的情况下用50 μM Val和Epi处理24小时。通过Western blotting检测HRAS、CDK2、HSP90AA1和KDR的蛋白表达(A-D)。

图8. RT-qPCR分析法测量Val和Epi对MPC5细胞中hras、cdk2、hsp90aa1、kdr的mRNA水平

细胞中hras、cdk2、hsp90aa1、kdr的mRNA表达(A-D)。与Control组相比，# p < 0.05, ## p < 0.01;与Model组相比，* p < 0.05, ** p < 0.01。

图9. Val和Epi对MPC5细胞中ROS的影响。

(A) Control组，(B) Model组，(C) DEX + ADR组，(D) Val + ADR组，(E) Epi + ADR组，(F) ROS水平的定量分析。与Control组相比，# p < 0.05, ## p < 0.01;与Model组相比，* p < 0.05, ** p < 0.01。

图10. TA对体重、尿液蛋白的影响

(A) 体重。

(B-G) 不同时间点尿液蛋白变化。与Control组相比，# p < 0.05, ## p < 0.01;与Model组相比，* p < 0.05, ** p < 0.01。

图11. TA对血清生化指标的影响

(A) 血清白蛋白(ALB)的变化。

(B) 总蛋白(TP)。

(C) 尿素氮(BUN)。

(D) 肌酐(CRE)在35天时的变化。与Control组相比，# p < 0.05, ## p < 0.01;与Model组相比，* p < 0.05, ** p < 0.01。

图12. TA对肾脏损伤的影响

左箭头显示肾小球纤维的弥漫性增生;右箭头显示淋巴细胞和浆细胞的浸润。原始放大倍数×200;比例尺=100 μM。ADR,阿霉素。

图13. 四种化合物对ADR注射诱导的小鼠体重和尿液蛋白的影响

(A) 体重。治疗后，每周对小鼠进行体重测量。

(B-E) 每周尿液蛋白变化的统计图表。与Control组相比，# p < 0.05, ## p < 0.01;与Model组相比，* p < 0.05, ** p < 0.01。

图14. 四种生物碱对ADR诱导的CGN小鼠血清生化指标的影响

(A-D) 第28天时血清白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)的变化。与Control组相比，# p < 0.05, ## p < 0.01;与Model组相比，* p < 0.05, ** p < 0.01。

图15. 四种化合物对肾脏损伤的影响。

上箭头显示肾小球纤维的弥漫性增生;下箭头显示淋巴细胞和浆细胞的浸润。原始放大倍数×200;比例尺=100 μM。

图16. A. scholaris中碱性物质干预ADR诱导的MPC5细胞分子机制。

Val和Epi调节MPC5细胞膜上的KDR蛋白，维持细胞膜结构的完整性，减少蛋白质的漏出;下调细胞内的HRAS和HSP90AA1蛋白，抑制细胞纤维化，并保护足细胞滤过功能;CDK2蛋白上调促进细胞增殖。此外，Val和Epi还抑制了线粒体中ROS的产生，减少了氧化应激对足细胞的损害。KDR,血管内皮生长因子受体2;HRAS,GTP酶HRas;HSP90AA1,热应激蛋白HSP 90-alpha;CDK2,周期素依赖性激酶2;ROS,活性氧。

研究结论

本研究使用阿霉素(ADR)诱导的肾小球肾病(CGN)小鼠模型和MPC5细胞模型，探讨A. scholaris提取物对CGN的治疗作用及其机制。

ADR诱导的CGN模型与人类慢性肾病的临床特征相似，通过引起足细胞脂质过氧化和蛋白尿，从而导致肾纤维化和炎症。

网络药理学预测PI3K-Akt途径可能是A. scholaris提取物及其四种主要生物碱(Val、Epi、Sch、Pic)干预CGN的主要途径。

在ADR诱导的MPC5细胞模型中，Val和Epi能够通过抑制HRAS表达、保护足细胞免受凋亡、降低KDR表达和促进CDK2介导的足细胞增殖，从而减轻CGN病理损伤。

ADR诱导的ROS过量产生可能导致足细胞损伤和蛋白尿，而Val和Epi可能通过防止ADR诱导的MPC5细胞中ROS的产生，减轻氧化应激相关的足细胞损伤。

本实验首次证明了A. scholaris的生物碱对CGN有显著影响，为在治疗其他慢性肾病或扩大临床适应症方面进一步研究其提供了基础。