IF7 USP35通过稳定ABHD17C并激活PI3K/AKT信号通路促进HCC发展

基本信息

英文标题：USP35 promotes HCC development by stabilizing ABHD17C and activating the PI3K/AKT signaling pathway

中文标题：USP35通过稳定ABHD17C并激活PI3K/AKT信号通路促进HCC发展

发表期刊：《Cell Death Discovery》

影响因子：7

作者单位：福建医科大学附属第二医院肝胆胰外科、浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科、中国人民解放军第910医院健康管理部

作者信息：Linpei Wang,Jiawei Wang,Xiaoqiu Ma,Guomin Ju,Chunfeng Shi,Wei Wang (通讯作者),Jian Wu (通讯作者).

研究背景

肝细胞癌(HCC)是最常见的肝癌类型，每年报告超过75万例病例。

已确定几种与HCC相关的风险因素，包括肝硬化、严重肝纤维化、酒精滥用、乙型/丙型肝炎病毒感染和代谢性疾病。

尽管有新药如索拉非尼用于治疗中期和晚期HCC，但HCC的治疗仍然具有挑战性且效率低下，因为存在药物耐药性和副作用。

S-棕榈酰化是一种可逆过程，其中16碳饱和脂肪酸与目标蛋白的Cys残基共价连接。

ABHD17C是一种新发现的去棕榈酰酶家族成员，可去除底物的S-棕榈酰化。

此前研究发现，miR-145-5p调节HCC细胞中ABHD17C的mRNA稳定性，但其翻译后修饰仍不清楚。

研究方法

文章描述了细胞培养、患者样本处理、生物信息学分析、质粒构建、细胞转染、蛋白质分析和一系列细胞功能测试的方法。

研究使用了多种技术，包括荧光素酶活性测定、qPCR、免疫沉淀、免疫印迹、MTT实验、集落形成实验、细胞周期和凋亡分析、Transwell实验以及动物移植瘤模型。

实验结果

图1. 多种USP影响ABHD17C稳定性

USP35、USP38、USP48过表达时，293T细胞中ABHD17C-Nluc活性最高。

免疫印迹证实USP35、USP38、USP48过表达，ABHD17C在USP35过表达细胞中最高。

图2. 人类肝细胞癌(HCC)样本中USP35和ABHD17C的表达水平升高，并与HCC和激活的PI3K/AKT途径呈正相关

A.USP35和ABHD17C在HCC样本中的表达水平升高。

B.USP35和ABHD17C的表达与HCC的发展和PI3K/AKT途径的激活相关。

C.在两个独立的数据集中，HCC样本的USP35和ABHD17C mRNA水平均上调。

D.USP35和ABHD17C的表达在HCC样本中呈正相关。

E.GSEA分析支持USP35或ABHD17C与PI3K/AKT途径的关联。

F.qPCR结果未显示HCC肿瘤组织与相邻正常组织之间USP35和ABHD17C mRNA水平的显著差异。

G.免疫印迹和IHC数据均表明HCC肿瘤组织中USP35和ABHD17C蛋白水平升高。

图3. USP35敲除影响HCC细胞功能

qPCR显示USP35敲除后，USP35 mRNA降低，ABHD17C mRNA变化不大。

免疫印迹显示USP35敲除后，ABHD17C、p-PI3K、p-AKT蛋白水平降低。

MTT和集落形成实验显示USP35敲除抑制HCC细胞增殖。

7-AAD和Annexin-V/PI染色显示USP35敲除促进HCC细胞凋亡。

Transwell实验显示USP35敲除减少HCC细胞迁移和侵袭。

图4. USP35与ABHD17C相互作用并去泛素化

MG132处理稳定ABHD17C蛋白。

Co-IP显示USP35与ABHD17C相互作用。

免疫印迹显示USP35敲除增加ABHD17C泛素化，加快ABHD17C降解。

图5. ABHD17C过表达挽救了USP35缺乏的HCC细胞的增殖缺陷

A. 免疫印迹数据显示，在USP35缺乏的Hep3B和SNU449细胞中过表达ABHD17C，可以恢复p-PI3K和p-AKT的水平至对照组相当的水平。

B. A图的定量结果。

C. MTT实验结果显示，USP35缺乏的HCC细胞的增殖可以被过量的ABHD17C挽救。

D. 集落形成实验数据显示，USP35缺乏的HCC细胞的集落形成能力可以通过ABHD17C过表达得到挽救。

E. D图的定量结果。

F. 7-AAD染色实验显示，USP35缺乏引起的HCC细胞周期停滞可以通过ABHD17C过表达得到挽救。

G. F图的定量结果。

OE表示过表达。

图6. ABHD17C过表达挽救了USP35缺乏的HCC细胞的凋亡、迁移和侵袭缺陷

A. Annexin-V/PI染色实验显示，USP35缺乏的HCC细胞增加的凋亡可以通过过量的ABHD17C减轻。

B. A图的定量结果。

C. Transwell实验结果显示，USP35缺乏的HCC细胞的迁移减弱可以通过ABHD17C过表达得到挽救。

D. C图的定量结果。

E. Transwell实验结果显示，USP35缺乏的HCC细胞的侵袭缺陷可以通过ABHD17C过表达得到挽救。

F. E图的定量结果。

OE表示过表达。

图7. USP35敲除抑制HCC移植瘤在体内的发展

A. qPCR结果确认，在稳定的Hep3B细胞中转染shUSP35后，USP35 mRNA表达有效敲除。

B. 免疫印迹结果显示，在USP35缺乏的稳定Hep3B细胞中，USP35表达显著减少。

C. B图的定量结果。

D. 肿瘤体积曲线显示，USP35敲除的HCC移植瘤生长受到抑制。

E. 终点时移植瘤的形态。

F. 终点时移植瘤重量的定量结果。

G. qPCR结果显示，与对照肿瘤相比，USP35敲除的HCC移植瘤中USP35 mRNA水平显著降低，而ABHD17C mRNA水平相当。

H. 免疫印迹数据显示，与对照肿瘤相比，USP35敲除的HCC移植瘤中USP35、ABHD17C、p-PI3K和p-AKT蛋白水平显著降低。

I. H图的定量结果。

J. H&E染色结果显示，USP35敲除的HCC移植瘤细胞密度较低。

K, L. IHC结果显示，Ki-67表达降低，表明USP35敲除的HCC移植瘤细胞增殖减少。

图8. USP35在调控HCC发展中的功能示意图

ABHD17C在细胞膜上去除N-RAS的棕榈酰化，释放N-RAS并促进N-RAS激活。

激活的N-RAS触发PI3K/AKT信号通路，促进HCC细胞的增殖、迁移和侵袭，但抑制凋亡。

ABHD17C被E3泛素连接酶泛素化，通过蛋白酶体介导的降解，这一过程被USP35逆转。

因此，ABHD17C被稳定化并持续促进N-RAS激活。

USP35是否通过其他机制(虚线)调控HCC发展需要进一步研究。

研究结论

USP35稳定了HEK293T细胞中的ABHD17C，表明ABHD17C的稳定性受泛素系统的调控，尤其是USP35。

在人类HCC样本中，USP35和ABHD17C的表达水平上调，两者之间有显著的相关性，且与PI3K/AKT通路的激活相关。

USP35敲除导致HCC细胞增殖、细胞周期停滞、凋亡增加以及迁移和侵袭能力减弱。

USP35与HCC细胞中的ABHD17C相互作用并稳定其表达，通过调节其泛素化。

ABHD17C过表达可以挽救USP35敲除引起的HCC细胞缺陷，表明ABHD17C在USP35的致癌功能中起重要作用。