环状RNA circ0007360通过改变miR-762/IRF7轴抑制胃癌进展

基本信息

英文标题：Circular RNA circ0007360 Attenuates Gastric Cancer Progression by Altering the miR-762/IRF7 Axis

中文标题：环状RNA circ0007360通过改变miR-762/IRF7轴抑制胃癌进展

发表期刊：《Scientific Report》

影响因子：5.5

作者单位：南昌大学第一附属医院消化内科、南昌大学第一附属医院妇产科

作者信息：Yawei Xing，Hongxia Chen，Zixiang Guo，Xiaodong Zhou.

研究背景

胃癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病与多种因素相关，包括胃幽门螺杆菌感染和炎症反应基因的突变。

胃癌的诊断往往较晚，导致五年生存率低于20%，因此，开发有效的生物标志物对于提高患者的生存率具有重要意义。

癌症干细胞(CSCs)和环状RNA(circRNA)在胃癌的发生和发展中起到了关键作用。CSCs是胃癌耐药性和转移复发的重要细胞群体，而circRNA作为非编码RNA，能够在细胞质中作为miRNA的海绵，影响miRNA的功能。

本研究主要关注一个研究较少的circRNA，即circ0007360，在胃癌细胞中的生物学效应及其分子机制。研究发现，circ0007360通过调节miR-762和其下游基因IRF7，影响胃癌细胞的生存、迁移、侵袭和干性。

这些发现为胃癌的诊断和治疗提供了新的潜在靶点，并有望改善胃癌患者的治疗效果。

研究方法

细胞培养和处理

人胃癌细胞系AGS和MKN-7购自IMMOCELL(中国福建厦门)。两种细胞系均在Eagle's基础培养基中培养，添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素。用Actinomycin D(1 μM; Sigma)检查RNA转录的稳定性，通过在指示的时间点处理细胞。

RNA荧光原位杂交(FISH)

使用RNA FISH方法检查circ0007360的定位和表达。根据Rabobio的荧光原位杂交试剂盒(C10910)的说明进行整个过程。使用的探针也来自Rabobio。

gDNA提取

从AGS细胞中使用Qiagen的DNeasy Blood和组织试剂盒(69504)分离总gDNA。使用不同的引物对circ007360和GAPDH进行聚合酶链反应(PCR)扩增。使用凝胶电泳分离cDNA或gDNA的PCR产物。

克隆

使用PCR扩增和连接到pCDNA3.1骨架生成circ0007360过表达构建。通过将退火的shRNA寡核苷酸插入到pLKO.1-TRC骨架生成circ0007360和IRF7 shRNA。使用pmirGLO(Promega)骨架扩增野生型circ0007360、突变型circ0007360、野生型IRF7 3′UTR或突变型IRF7 3′UTR报告构建。

实时定量PCR(RT-qPCR)

使用Vazyme Biotech的Total RNA提取试剂盒(南京;中国)从细胞中提取总RNA。然后，将1 μg RNA在Vazyme Biotech的HiScript II First Strand cDNA合成试剂盒中逆转录。接下来，在Bio-Rad的iQ5 qPCR仪上进行定量PCR，以检测目标基因的相对表达水平。使用2-ΔΔCt公式定量各种目标基因，以18S RNA作为参考转录物进行标准化。

RNase R处理

将1 μg RNA稀释在40 μL水中，加入4 U RNase R(Thermo Fisher)，37°C孵育15分钟。

亚细胞分馏

使用PARIS™试剂盒(Thermo Fisher; AM 1921)从细胞质或细胞核中提取总RNA，以检测circ0007360的定位。

转染

将细胞接种到6孔板的孔中，根据制造商的说明，使用Lipofectamine 3000(Invitrogen)转染4 μg质粒或200 pmol miRNA模拟物或抑制剂。

荧光素酶报告基因分析

AGS细胞与指示的荧光素酶报告基因质粒和miR-762模拟物或模拟物NC共转染。转染48小时后，裂解细胞，使用Promega的Dual-Glo荧光素酶分析系统测量荧光素酶活性。

MTT实验

简要来说，转染24小时后，将细胞以1×103细胞/孔的密度接种到96孔板中。在指示的时间点直接向每个孔中加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液(Qiancheng Biotech，中国)。在37°C孵育4小时后，用100 μL DMSO替换培养基，并在490 nm处使用SpectraMax Absorbance Reader(Molecular Devices)测量吸光度。结果以平均值±标准差(n=6)表示。

集落形成实验

转染后24小时，将500个细胞接种到6孔板的孔中。在37°C培养2周后，用4%多聚甲醛固定10分钟。使用0.5%结晶紫染色10分钟。用清水洗涤3次后，拍摄和计数染色细胞集落。

流式细胞术

24小时转染后，用70%乙醇固定细胞过夜。随后，用PBS洗涤两次，然后用含Triton X-100(0.2%)和RNase(10 μg/mL)的PBS缓冲液进行通透，30分钟。随后，用20 μg/mL PI(Vazyme Biotech)在室温下染色

实验结果

图1. circ0007360是一种环状RNA

(A) 显示circ0007360基因组定位、用于检测circ0007360表达的 divergent和convergent引物对的位置，以及连接位点的Sanger测序结果的示意图。

(B) PCR产物通过指示的引物扩增circ0007360或GAPDH的DNA凝胶结果。

(C) RT-qPCR定量ATF6或circ007360的RNA水平，有无RNase R处理。

(D) RT-qPCR定量ATF6或circ007360的RNA水平，有无actinomycin D处理，以及不同时间点的处理。

图2. circ0007360是一种细胞质环状RNA，可能与miR-762结合

(A) RNA荧光原位杂交(FISH)的代表性图像，用于检测circ0007360、18S或U6 RNA。DAPI用于染色细胞核。

(B) 亚细胞分馏实验，用于测量核或细胞质中U6、GAPDH或circ0007360的水平。

(C) 显示野生型(WT)或突变型(MUT) circ0007360与miR-762相互作用位点的示意图。

(D) 在有无miR-762模拟物的情况下，WT或MUT circ0007360构建的相对荧光素酶活性。

图3. circ0007360抑制而miR-762增强细胞存活

(A) RT-qPCR定量circ0007360或miR-762的表达，在AGS或MKN-7细胞中过表达circ0007360、敲低circ0007360或miR-762。

(B) MTT实验检测细胞在circ0007360过表达、circ0007360敲低或miR-762过表达下的增殖情况。

(C,D) circ0007360过表达、circ0007360敲低或miR-762过表达细胞集落形成的代表性图像(C)和定量(D)。

(E,F) circ0007360过表达、circ0007360敲低或miR-762过表达细胞周期分析的流式细胞术代表性图像(E)和定量(F)。

(G,H) circ0007360过表达、circ0007360敲低或miR-762过表达细胞凋亡分析的流式细胞术代表性图像(G)和定量(H)。

图4. circ0007360抑制而miR-762增强细胞迁移和侵袭

(A,B) circ0007360过表达、circ0007360敲低或miR-762过表达细胞迁移(A)或侵袭(B)的Transwell结果的代表性图像和定量。

图5. circ0007360抑制而miR-762增强胃细胞干性

(A) circ0007360过表达、circ0007360敲低或miR-762过表达细胞肿瘤球形成，以测量干性的代表性图像和定量。

(B) circ0007360过表达、circ0007360敲低或miR-762过表达细胞表面CD44和EpCAM表达的流式细胞术分析的代表性图像和定量。

(C) circ0007360过表达、circ0007360敲低或miR-762过表达细胞中干性标志物表达的Western Blotting检测的代表性图像和定量。

图6. circ0007360的肿瘤抑制作用是由miR-762的抑制所介导的

(A) AGS细胞中circ0007360或miR-762的表达在circ0007360敲低和miR-762重表达后的RT-qPCR分析。

(B) 在AGS细胞中circ0007360敲低和miR-762重表达后的MTT实验。

(C) circ0007360敲低和miR-762重表达的AGS细胞集落形成的代表性图像和定量。

(D) circ0007360敲低和miR-762重表达的AGS细胞流式细胞术细胞周期分析的代表性图像和定量。

(E) circ0007360敲低和miR-762重表达的AGS细胞流式细胞术凋亡分析的代表性图像和定量。

(F,G) circ0007360敲低和miR-762重表达的AGS细胞Transwell结果的代表性图像和定量，用于检测迁移(F)或侵袭(G)。

(H) circ0007360敲低和miR-762重表达的AGS细胞肿瘤球形成，以测量干性的代表性图像和定量。

(I) circ0007360敲低和miR-762重表达的AGS细胞流式细胞术分析CD44和EpCAM表达的代表性图像和定量。

图7. IRF7是miR-762的靶mRNA

(A) 显示三个数据库预测miR-762靶基因交集的韦恩图。

(B) 显示野生型(WT)或突变型(MUT)IRF7 3′UTR与miR-762相互作用位点的示意图。

(C) 在有无miR-762模拟物的情况下，WT或MUT IRF7 3′UTR的相对荧光素酶活性。

(D,E) AGS细胞中circ0007360过表达、circ0007360敲低或miR-762过表达对IRF7表达的RT-qPCR(D)或Western Blotting(E)定量。

(F) AGS或MKN-7细胞中circ0007360过表达、circ0007360敲低或miR-762过表达对IRF7蛋白水平的定量。

图8. miR-762的促肿瘤功能依赖于IRF7的下调

(A) 存在或不存在miR-762抑制剂或IRF7 shRNA时IRF7 mRNA表达的RT-qPCR检测。

(B) 存在或不存在miR-762抑制剂或IRF7 shRNA时Western Blotting检测IRF7蛋白水平的代表性图像和定量。

(C) AGS细胞中存在或不存在miR-762抑制剂或IRF7 shRNA的MTT分析。

(D) 存在或不存在miR-762抑制剂或IRF7 shRNA时AGS细胞集落形成的代表性图像和定量。

(E) 存在或不存在miR-762抑制剂或IRF7 shRNA时AGS细胞流式细胞术细胞周期分析的代表性图像和定量。

(F) 存在或不存在miR-762抑制剂或IRF7 shRNA时AGS细胞流式细胞术凋亡分析的代表性图像和定量。

(G,H) 存在或不存在miR-762抑制剂或IRF7 shRNA时AGS细胞Transwell结果的代表性图像和定量，用于检测迁移(G)或侵袭(H)。

(I) 存在或不存在miR-762抑制剂或IRF7 shRNA时AGS细胞肿瘤球形成，以测量干性的代表性图像和定量。

(J) 存在或不存在miR-762抑制剂或IRF7 shRNA时AGS细胞流式细胞术分析CD44和EpCAM表达的代表性图像和定量。

图9. circ0007360的敲低增强了小鼠胃肿瘤的形成

(A) 通过皮下注射在裸鼠中形成的circ0007360敲低的细胞所形成的肿瘤的代表性图像。

(B,C) AGS细胞中circ0007360敲低通过皮下注射在小鼠中形成的肿瘤体积(B)和肿瘤重量的定量(C)。

(D–F) 通过皮下注射在小鼠中形成的AGS细胞中circ0007360敲低形成的肿瘤中，通过RT-qPCR检测circ0007360 (D)、miR-762 (E)或IRF7 (F)的RNA水平。

(G,H) 通过皮下注射在小鼠中形成的AGS细胞中circ0007360敲低形成的肿瘤中，Western Blotting检测IRF7及其在细胞干性调节中的标志物(G)的代表性图像和定量(H)。

(I,J) 通过皮下注射在小鼠中形成的AGS细胞中circ0007360敲低形成的肿瘤中，免疫组化染色检测Ki67的代表性图像(I)和定量(J)。

研究结论

circ0007360被表征为一种细胞质circRNA，并在胃肠道癌细胞中表达。

circ0007360对胃肠道癌细胞的存活、迁移、侵袭和干性有抑制作用。

miR-762是circ0007360的一个直接靶miRNA，并在circ0007360不存在的情况下，被证明是实现肿瘤促进作用的关键下游转录物。

干扰素调节因子7(IRF7)，验证为miR-762的靶基因，作为circ0007360的间接靶基因，以减轻胃肠道癌的进展。

体内实验证实，circ0007360的耗竭增强了胃肠道癌细胞生长和干性。

circ0007360/miR-762/IRF7轴的激活是胃肠道癌进展减缓的新机制。

本研究揭示了circ0007360在胃肠道癌患者中的诊断和治疗价值。