稳定表达 CD19-FLUC-GFP 的 CT26 细胞系的构建及鉴定

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。逸漠生物自主研发了近200种表达Fluc的细胞系，均经过荧光素酶活性检测验证，可满足科研人员的多样化需求，欢迎咨询。

基本信息

英文标题：Construction and identification of a stable CT26 cell line expressing CD19-FLUC-GFP

中文标题：稳定表达 CD19-FLUC-GFP 的 CT26 细胞系的构建及鉴定

发表期刊：《Chinese Journal of Biotechnology》(《生物工程学报》)

影响因子：国内期刊，木有因子

作者单位：

1. 湖北工业大学生物工程与食品学院

2. 武汉滨会生物科技股份有限公司

3. 湖北工业大学生物工程与食品学院

作者信息：郭雨洁, 段海潇, 程奕宁

研究背景

实体瘤因缺乏明确的CAR-T治疗靶点，限制了其免疫疗法的应用。CD19作为B细胞成熟的关键分子，在血液肿瘤的CAR-T治疗中效果显著，但在实体瘤中缺乏天然表达。本研究通过慢病毒系统将CD19基因与荧光素酶(FLUC)、绿色荧光蛋白(GFP)共同导入结肠癌细胞系CT26，构建稳定表达CD19-FLUC-GFP的细胞模型，旨在为CD19 CAR-T细胞治疗实体瘤提供体外和体内评价工具。该模型通过荧光和生物发光标记，便于动态监测肿瘤生长及CAR-T细胞的靶向杀伤效果，为实体瘤免疫治疗研究提供新思路。

研究方法

研究采用三质粒慢病毒系统构建重组载体pCDH-CMV-CD19-P2A-FLUC-EF1α-GFP，通过PCR扩增CD19基因并与载体连接。病毒包装后转导CT26细胞，经嘌呤霉素筛选获得稳转细胞系。通过流式细胞术检测CD19和GFP的持续表达，实时无标记细胞分析仪(RTCA)评估细胞生长活性，qPCR验证CD19 mRNA水平，酶标仪检测FLUC活性。体内实验通过腹腔注射稳转细胞至BALB/c小鼠，利用活体成像观察肿瘤荧光素酶表达。最后，通过CAR-T细胞与靶细胞共培养实验验证特异性杀伤效果。

实验结果

图1：慢病毒质粒构建

A: PCR鉴定.M:2000 bp DNAmarker;1:CD19 片段;2:CD19-P2A 片段。B: 菌落 PCR.M:5000 bp DNA marker;1-9:单克隆菌落;10:阴性对照。C: 双酶切鉴定.M:15000 bpDNA marker;1:双酶切片段(XbaI和 EcoR I)。D: 质粒构建示意图。

图2：慢病毒包装及滴度检测

A: 在转染后的 24、48 和 72 h、使用荧光显微镜(10 倍放大)检测 293T细胞中 GFP 表达。

B: 通过流式细胞术检测 293T 细胞上的 CD19 和 GFP 表达.1:对照组 293T细胞;2:转染后 72h的 293T 细胞。

C: 通过流式细胞术检测不同稀释梯度下的慢病毒的 GFP 表达.1:293T 细胞:2-4:浓缩前分别稀释了 10、100 和1000倍的病毒 GFP 表达;5-7:浓缩后分别稀释了 10、100 和1000 倍的病毒 GFP 表达。

图3：单克隆细胞系的筛选

A: CT26 细胞对于嘌呤霉素的敏感曲线。

B: 用流式细胞仪检测筛选出的单克隆细胞系中 CD19和 GFP的表达。

C: 用免疫印迹法检测筛选出的单克隆细胞系中 CD19 的表达。

D: 使用显微镜在白光下(100倍放大)观察筛选出的单克隆细胞系 G7。

E: 用荧光显微镜(100 倍放大)检测筛选出的单克降细胞系 G7 中 GFP的表达。

图4：CT26-CD19-FLUC-GFP 与CT26 细胞生长活性比较

图5

不同代次 CT26-CD19-FLUC-GFP 细胞的 CD19及 GFP表达在连续传代5代(A)、10 代(B)和22 代(C)后检测 CT26-CD19-FLUC-GFP 细胞中 CD19 和 GFP 的表达.D:细胞冷冻保存一年后CT26-CD19-FLUC-GFP 细胞连续传代 10 代，检测 GFP 和 CD19 的表达。

图6

CT26-CD19-FLUC-GEP 细胞中ICDI9mRNA 的表达与 CT26 细胞系相比，CT26-CD19-FLUC-GFP 细胞系中 CD19 mRNA 显著上调表达(***:P<0.001，t-检验)。

图7

检测 CT26-CD19-FLUC-GEP 细胞的 FLUC表达与 CT26 细胞系相比，CT26-CD19-FLUCGFP 细胞系中 FLUC 的表达显著上调(****P<0.0001，t-检验)。

图8

CD19-CAR-T 细胞对其靶细胞的杀伤CD19 CAR-T 细胞对 CT26-CD19-FLUC-GFP 细胞(A)和MC38-CD19 细胞(B)的杀伤作用

图9

CT26-CD19-FLUC-GFP 稳转细胞系体内成瘤和 FLUC 的表达A:对照组小鼠腹腔内植入 CT26细胞.B:实验组小鼠腹腔内植人 CT26-CD19-FLUC-GFP 细胞.C:CT26-CD19-FLUC-GFP 组小鼠与 CT26组相比，FLUC的表达显著上调(****:P<0.0001，t-检验)。

研究结论

成功构建了稳定表达CD19-FLUC-GFP的CT26细胞系(CT26-CD19-FLUC-GFP)，其生长特性与原始细胞一致，且CD19和GFP在连续传代22代及冻存复苏后仍稳定表达。qPCR和荧光素酶活性检测显示CD19 mRNA及FLUC表达显著高于对照组。CAR-T细胞对稳转细胞及MC38-CD19细胞的特异性杀伤效果显著强于普通T细胞。体内实验证实，稳转细胞在小鼠腹腔中可稳定表达FLUC，为CAR-T疗法的体内评价提供了可靠模型。