gHgL-gp42复合物上的非重叠表位用于合理设计抗EBV感染的三抗体组合

基本信息

英文标题：Non-overlapping epitopes on the gHgL-gp42 complex for the rational design of a triple-antibody cocktail against EBV infection.

中文标题：gHgL-gp42复合物上的非重叠表位用于合理设计抗EBV感染的三抗体组合

发表期刊：《Cell Reports Medicine》

影响因子：14.3

作者单位：厦门大学与中山大学肿瘤防治中心

作者信息：洪俊平、刘丽琴、吴倩、陈开允、魏冬梅，中山大学肿瘤防治中心钟玲、张琬琳(共一)，国家工程中心夏宁邵、陈毅歆、郑清炳，中山大学肿瘤防治中心、重庆医科大学张晓，中山大学肿瘤防治中心徐淼(共同通讯作者).

研究背景

Epstein-Barr virus (EBV) 与多种疾病有关，目前尚无批准的疫苗或治疗方法。研究者们表征了针对gHgL-gp42复合物不同组分的抗体，展示了体外协同中和和体内三重抗体格式的强大保护作用，为治疗或疫苗的合理设计提供了见解。

研究方法

通过抗体结合竞争实验、表面等离子共振(SPR)分析、中和实验、人类化小鼠模型的保护实验、冷冻电镜(cryo-EM)结构分析等方法，研究了针对EBV gHgL-gp42复合物的三种抗体(anti-gp42 5E3、anti-gHgL 6H2 和 anti-gHgL 10E4)的结合特性和中和机制。

实验结果

1. 爱泼斯坦-巴尔病毒与多种疾病相关，但目前缺乏批准的疫苗。

2. Hong等人发现了针对gHgL-gp42复合物不同组分的抗体，具有协同中和作用。

3. 三项抗体组合在体内实验中展现出强大的保护效果，为疫苗和治疗方法的研发提供了新思路。

图1：通过SPR技术测量了抗-gp42和抗-gHgL单抗的结合亲和力。

使用流式细胞术评估了这些单抗与EBV阳性细胞表面蛋白的结合活性。

研究了抗体及抗体混合物对EBV感染的中和作用，并计算了半最大抑制浓度(IC50)。

图2：5E3和5E3+6H2+10E4混合物对人体化小鼠致命EBV挑战提供强大的保护作用

(A) CD34+造血干细胞(HSC)植入、抗体输注、EBV挑战以及各种生物学和临床结果的监测实验时间表。在Akata-EBV(25,000 GRUs)静脉(i.v.)挑战前24小时，通过腹腔注射(i.p.)给予NPI小鼠总计400 mg的5E3(n=6)、10E4(n=6)、5E3+6H2+10E4混合物(n=6)、AMMO1(阳性对照，n=5)和VRC01(阴性对照，n=5)。未感染对照小鼠(n=3)未接受抗体或病毒注射。在第10周内，每周记录体重、动物生存情况、外周血中EBV DNA拷贝数和免疫表型。第10周时，对人化小鼠进行安乐死，并收集脾脏进行进一步分析。

(B–D) 每周监测小鼠的体重(B)、生存情况(C)和外周血样本中EBV DNA拷贝数(D)。(D)中的每条线代表一只小鼠;检测限(10拷贝/mL)由虚线表示。体重转换为百分比。

(E–I) 使用流式细胞术分析了外周血中hCD45+(E)、hCD19+(F)、hCD3+(G)、hCD8+(H)和hCD4+(I)细胞比例的百分比变化。

图3：四种抗体结合的gHgL和gp42的复合冷冻电镜结构

(A 和 B) gHgL-gp42:5E3:3E8:6H2:10E4复合物在3.59埃分辨率下的冷冻电镜密度图。gp42以粉色表示，gH D-I与gL、D-II、D-III和D-IV分别以深卡其色、矢车菊蓝色、中等绿松石色和钢青色表示。3E8、5E3、6H2和10E4的密度分别以橙色、青色、红色和紫色表示。

(C)3E8和5E3结合的gp42(gp42:5E3:3E8)、6H2结合的gH(gH:6H2)和10E4结合的gHgL(gHgL:10E4)的局部精炼密度图分别解析到3.64埃、3.52埃和3.54埃分辨率。

(D) gHgL-gp42:5E3:3E8:6H2:10E4的原子模型。单抗3E8、5E3、6H2和10E4以卡通形式展示;gHgL和gp42也以卡通形式展示，并带有透明表面表示。深色和浅色用于区分每个抗体的重链和轻链。

图4：5E3、6H2和10E4干扰EBV细胞结合和细胞融合

(A 和 B) 通过竞争性ELISA使用抗-gp42中和抗体3E8和5E3 (A) 以及抗-gHgL中和抗体6H2、10E4和6H2+10E4混合物 (B) 评估了健康EBV携带者和NPC患者的血清阻断率。(E 和 F) 抗-EBV中和抗体对抗B细胞 (E) 和上皮细胞 (F) 模拟EBV膜融合的抑制效力。

(C 和 D) 抗-EBV中和抗体对抗EBV糖蛋白与Akata B细胞 (C) 和AGS上皮细胞 (D) 结合的抑制效力。gHgL-gp42复合物 (C) 或gHgL (D) 在与Akata B细胞 (C) 或AGS上皮细胞 (D) 结合前与单抗或PBS预孵育。结合效率通过流式细胞术测量，并显示了平均荧光强度(MFI)。抗体混合物由等比例的单抗组成，且抗体混合物和单抗剂量总的浓度相同。使用了阳性对照AMMO1和阴性对照VRC01。

(E 和 F) 抗-EBV中和抗体对抗B细胞 (E) 和上皮细胞 (F) 模拟EBV膜融合的抑制效力。

(G) 使用SPR评估了抗-gp42中和抗体对抗固定在芯片上的gp42与HLA-II结合的阻断作用。

(H) 使用SPR检测了抗-gHgL中和抗体对抗固定在芯片上的gHgL-gp42复合物与HLA-II结合的阻断作用。

(I)使用SPR检测了抗-gHgL中和抗体对抗固定在芯片上的EphA2与gHgL结合的阻断作用。

(J) HLA-II结合位点(黄色)与5E3(青色线内)和6H2(红色线)的足迹结构比较。

(K) 6H2可变域和HLA-II(PDB: 1KG0)结构与gHgL-gp42复合物的叠加显示立体冲突(以黑色虚线圆圈表示)。

(L) 10E4可变域和EphA2-LBD(PDB: 7CZE)结构的叠加显示没有表位重叠或立体冲突。

图5：抗-gp42和抗-gHgL中和抗体的拟议中和机制

(A) gHgL-gp42复合物与HLA-II在B细胞感染期间相互作用的示意图，gHgL与EphA2在上皮细胞感染期间的相互作用，以及gB的构象变化。膜融合是通过这种预融合(Pre)到后融合(Post)状态的变化来介导和促进的。

(B–D) 5E3 (B)、6H2 (C) 和 10E4 (D) 中和机制示意图。

(B) 5E3结合到一个与gp42上HLA-II结合位点重叠的表位，因此通过直接阻断gp42与HLA-II的相互作用，限制gHgL-gp42复合物与B细胞表面的结合。

(C) 6H2结合到gHgL的D-IV结构域并引起立体冲突，干扰gHgL-gp42复合物与HLA-II的结合，从而抑制随后的膜融合。

(D) 10E4主要结合到gL的一个表位，并通过破坏一个关键的gL环来抑制gL与EphA2的结合，这个环可能阻止gL与EphA2的相互作用。

研究结论

研究发现，三种中和抗体(5E3、6H2和10E4)针对EBV病毒的gHgL-gp42复合物的不同区域，并在体外显示出协同抑制EBV感染的效果。这些抗体通过不同的机制中和病毒，包括阻断结合、造成立体障碍和引起构象变化。结构分析揭示了这些抗体在病毒表面的结合位置，而功能分析强调了它们对病毒感染过程的干扰作用。

在人类化小鼠模型中，5E3单克隆抗体和基于5E3的三重抗体组合对EBV感染提供了有效的保护。这表明这些抗体在体内环境中同样有效，并且可能对EBV相关的疾病治疗具有潜在价值。

结构和功能分析强调了理解gHgL-gp42复合物对于设计针对EBV感染的治疗性抗体混合物或疫苗的重要性。这些研究成果为开发针对EBV的新型治疗策略提供了重要的理论基础。抗体混合物的研究可能为未来开发针对EBV的治疗方法提供新的方向，特别是在预防和治疗EBV相关疾病方面。