m6A介导的IGFL2-AS1/AR轴诱导的血管拟态参与了肾透明细胞癌对帕唑帕尼的耐药

基本信息

英文标题：Vascular mimicry induced by m6A mediated IGFL2-AS1/AR axis contributes to pazopanib resistance in clear cell renal cell carcinoma.

中文标题：m6A介导的IGFL2-AS1/AR轴诱导的血管拟态参与了肾透明细胞癌对帕唑帕尼的耐药

发表期刊：《Cell Death Discovery》

影响因子：7

作者单位：西南医科大学

作者信息：Bo Cheng，Mingyue Xie，Yong Zhou，Tian Li，Wanting Liu，Wenjing Yu，Man Jia，Shuang Yu，Lixuan Chen，Rongyang Dai (通讯作者)，Ronghao Wang (通讯作者).

研究背景

转移性透明细胞肾癌(ccRCC)是一种致命的肾癌亚型。血管拟态(VM)被认为是肿瘤获取营养的替代途径，在肿瘤发展中起着关键作用。然而，VM的发展是否与帕唑帕尼的疗效相关尚不清楚。

研究方法

通过体外和体内模型，研究发现与敏感对照组相比，帕唑帕尼耐药的ccRCC中VM的发展显著增加，这是由于IGFL2-AS1/AR/TWIST1信号通路的激活。研究通过一系列实验方法，包括细胞培养、质粒构建、病毒包装、组织染色、VM形成测定、RNA免疫沉淀、原位杂交、细胞核分离、RNA提取和定量PCR、西方印迹分析、荧光素酶报告基因检测、共识聚类分析、免疫组化染色和体内研究等，探讨了IGFL2-AS1/AR轴在帕唑帕尼耐药ccRCC中的作用。

实验结果

A. 肿瘤生长曲线：

帕唑帕尼或对照处理的小鼠肿瘤生长曲线。每两天腹腔注射10 mg/kg帕唑帕尼。

B. CD31/PAS染色：

帕唑帕尼或对照处理的肿瘤切片进行CD31/PAS染色。左侧为代表性图像，右侧为统计分析。红色箭头：血管;黑色箭头：肿瘤细胞的血管拟态。

C. 血管拟态形成实验：

OSRC-2和A498细胞在帕唑帕尼耐药前后进行血管拟态形成实验。左侧为代表性图像，右侧为统计分析。

D. QPCR检测：

QPCR检测显示OSRC-2和A498细胞在帕唑帕尼耐药前后血管拟态相关基因的表达模式。基因表达水平以GAPDH mRNA为对照进行标准化。

E. Western blotting分析：

Western blotting显示OSRC-2和A498细胞在帕唑帕尼耐药前后AR蛋白的表达水平。GAPDH作为加载对照。

F. 短暂帕唑帕尼处理：

短暂的帕唑帕尼处理也促进了OSRC-2和A498细胞中AR的表达。GAPDH作为内部对照。

G. AR抑制实验：

使用shRNAs或恩杂鲁胺抑制AR，可以抑制OSRC-2和A498帕唑帕尼耐药细胞的血管拟态发展。左侧为代表性图像，右侧为统计分析。

H. AR抑制对TWIST1表达的影响：

使用shRNAs或恩杂鲁胺抑制AR，可以降低OSRC-2和A498帕唑帕尼耐药细胞中TWIST1的表达。GAPDH作为加载对照。

I. AR敲低后的敏感性：

敲低AR可以使OSRC-2和A498帕唑帕尼耐药细胞重新对帕唑帕尼治疗敏感。

J. AR表达水平与血管拟态的关系：

高AR表达的ccRCC倾向于具有更多的血管拟态数量，而低AR表达的ccRCC则相反。

要点：

研究揭示了AR介导的血管拟态是ccRCC对帕唑帕尼耐药的机制之一。

通过多种实验方法，如染色、QPCR、Western blotting等，验证了AR在耐药细胞中的表达和功能。

抑制AR可以减缓耐药细胞的血管拟态发展，并恢复对帕唑帕尼的敏感性。

A. 核糖体分析：

使用多核糖体分析方法和随后的qPCR检测，研究了A498和OSRC-2细胞在帕唑帕尼耐药前后与核糖体结合的AR mRNA的富集情况。

B. 热图分析：

热图显示了在转移性ccRCC中高表达的50个长链非编码RNA(lncRNA)。

C. qPCR检测：

qPCR检测了OSRC-2细胞在帕唑帕尼敏感和耐药状态下这50个转移性lncRNA的表达水平。基因表达水平以GAPDH mRNA为对照进行标准化。

D. shRNA抑制实验：

在OSRC-2(左)和A498(右)帕唑帕尼耐药细胞中，通过shRNA抑制lncRNA候选基因后，检测了AR的表达水平。GAPDH作为加载对照。

E. IGFL2-AS1敲低实验：

敲低IGFL2-AS1可以抑制OSRC-2和A498帕唑帕尼耐药细胞的血管拟态发展。左侧为代表性图像，右侧为统计分析。

F. IGFL2-AS1敲低对帕唑帕尼敏感性的影响：

敲低IGFL2-AS1可以恢复OSRC-2和A498帕唑帕尼耐药细胞对帕唑帕尼的敏感性。

G. IGFL2-AS1敲低对核糖体结合的影响：

敲低IGFL2-AS1可以减少AR mRNA与核糖体的结合。

要点：

研究确定了IGFL2-AS1是帕唑帕尼耐药ccRCC细胞中AR的上游调控因子。

通过多核糖体分析，发现AR mRNA在耐药细胞中与核糖体的结合增加。

热图分析揭示了转移性ccRCC中高表达的lncRNA。

敲低IGFL2-AS1可以抑制耐药细胞的血管拟态，并恢复其对帕唑帕尼的敏感性。

IGFL2-AS1敲低减少了AR mRNA与核糖体的结合，表明IGFL2-AS1可能通过调节AR的翻译来发挥作用。

A. IGFL2-AS1的FISH染色：

在帕唑帕尼耐药的ccRCC细胞中进行了IGFL2-AS1的荧光原位杂交(FISH)染色。

B. 细胞质-细胞核分离：

通过细胞质-细胞核分离实验来识别IGFL2-AS1的位置。细胞质RNA以GAPDH为标记;细胞核RNA以MALAT1为标记。

C. RNA免疫沉淀(RNA IP)：

使用针对AR mRNA的4个反义探针进行RNA IP，以检测IGFL2-AS1的富集。AS表示反义探针;S表示正义探针。

D. IGFL2-AS1与AR mRNA的相互作用：

插图显示了IGFL2-AS1与AR mRNA的相互作用。

E. RNA结构分析：

左侧：使用RNAfold Webserver预测的IGFL2-AS1的RNA结构。右侧：截断映射显示含有AR结合位点的片段3#与AR mRNA相互作用。

F. 帕唑帕尼处理对AR表达的影响：

帕唑帕尼处理增加了OSRC-2和A498细胞中具有野生型5'-UTR的AR的表达，但未增加具有ATG缺失的5'-UTR的AR的表达。IGFL2-AS1增强了具有野生型5'-UTR的AR的表达，但未增强具有ATG缺失的5'-UTR的AR的表达。GAPDH作为内参。

G. 构建AR 5'-UTR启动子报告基因：

插图显示了野生型和突变型AR 5'-UTR携带的荧光素酶报告基因构建过程。

H. 帕唑帕尼和IGFL2-AS1对AR 5'-UTR活性的影响：

帕唑帕尼和IGFL2-AS1增强了OSRC-2细胞中野生型AR 5'-UTR携带的荧光素酶的活性，但未增强突变型AR 5'-UTR的活性。

要点：

研究表明IGFL2-AS1调节AR mRNA的上游开放阅读框(uORF)活性，并促进其翻译。

IGFL2-AS1位于细胞核中，并通过与AR mRNA相互作用来调节AR的表达。

IGFL2-AS1通过增强具有野生型5'-UTR的AR的表达来促进AR的翻译。

帕唑帕尼和IGFL2-AS1协同作用于野生型AR 5'-UTR，提高了活性。

A. IGFL2-AS1对ccRCC血管拟态形成和帕唑帕尼耐药的贡献：

野生型IGFL2-AS1，而不是突变型，在A498和OSRC-2细胞中增加了AR的表达。GAPDH作为正常化对照。

B. 野生型IGFL2-AS1对A498和OSRC-2细胞VM形成的影响：

野生型IGFL2-AS1，而不是突变型，增加了A498和OSRC-2细胞的血管拟态发展。左侧为代表性图像;右侧为统计分析。标尺：200 μm。

C. 野生型IGFL2-AS1对TWIST1表达的影响：

野生型IGFL2-AS1，而不是突变型，在A498和OSRC-2细胞中增加了TWIST1的表达。GAPDH作为加载对照。

D. 野生型IGFL2-AS1促进帕唑帕尼耐药的能力：

野生型IGFL2-AS1比突变型具有更强的能力促进A498和OSRC-2细胞的帕唑帕尼耐药性。

E. 恩杂鲁胺对IGFL2-AS1诱导的VM形成的影响：

恩杂鲁胺处理减轻了IGFL2-AS1在A498和OSRC-2细胞中诱导的血管拟态发展。左侧为代表性图像;右侧为统计分析。标尺：200 μm。

F. 恩杂鲁胺对IGFL2-AS1诱导的帕唑帕尼耐药性的影响：

恩杂鲁胺处理消除了IGFL2-AS1诱导的ccRCC细胞的帕唑帕尼耐药性。

G. 野生型IGFL2-AS1促进AR翻译的能力：

使用多核糖体分析(polysome profiling)法监测，野生型IGFL2-AS1比突变型具有更强的能力促进AR的翻译。

要点：

IGFL2-AS1的结合对于ccRCC血管拟态形成和帕唑帕尼耐药性是必需的。

野生型IGFL2-AS1能够增加AR和TWIST1的表达，促进血管拟态的发展，并增强帕唑帕尼耐药性。

恩杂鲁胺可以减轻IGFL2-AS1诱导的血管拟态发展和帕唑帕尼耐药性。

野生型IGFL2-AS1在促进AR翻译方面比突变型更有效。

A. IGFL2-AS1的m6A修饰：

pazopanib处理导致IGFL2-AS1的m6A修饰去甲基化，并由YTHDF2释放而稳定。

分析根据GSE161304 miCLIP数据集对IGFL2-AS1的m6A峰进行分析。红色框表示m6A峰。

B. m6A水平比较：

SRAMP预测的高置信度m6A位点。底部，m6A RIP揭示了帕唑帕尼敏感和耐药的ccRCC细胞中IGFL2-AS1的m6A水平差异。P1、P2是检测IGFL2-AS1指定区域的引物对。

C. m6A调节剂的表达水平：

帕唑帕尼敏感和耐药的ccRCC细胞中m6A调节剂的mRNA表达水平。RNA水平以GAPDH mRNA为对照进行标准化。

D. METTL14敲低：

使用两种独立的siRNA敲低METTL14，降低了A498和OSRC-2细胞中IGFL2-AS1的m6A水平。

E. METTL14敲低对IGFL2-AS1表达的影响：

使用两种独立的siRNA敲低METTL14，增加了A498和OSRC-2细胞中IGFL2-AS1的表达。GAPDH mRNA作为内参。

F. METTL14与IGFL2-AS1的关系：

METTL14在TCGA-KIRC中与IGFL2-AS1呈负相关。

G. dCas9 CRISPR-FTO系统：

dCas9 CRISPR-FTO结合sgRNA靶向IGFL2-AS1的A984相邻区域，显著增加了A498和OSRC-2细胞中IGFL2-AS1的表达。RNA水平以GAPDH mRNA为对照进行标准化。

H. dCas9 CRISPR-FTO系统对AR和TWIST1表达的影响：

dCas9 CRISPR-FTO结合sgRNA靶向IGFL2-AS1的A984相邻区域，增强了A498和OSRC-2细胞中AR和TWIST1的表达。GAPDH作为加载对照。

I. dCas9 CRISPR-FTO系统对VM形成的影响：

dCas9 CRISPR-FTO结合sgRNA靶向IGFL2-AS1的A984相邻区域，促进了A498和OSRC-2细胞的血管拟态(VM)发展。左侧为代表性VM图像;右侧为VM的统计分析。标尺：200 μm。

J. dCas9 CRISPR-FTO系统对IGFL2-AS1稳定性的影响：

dCas9 CRISPR-FTO结合sgRNA靶向IGFL2-AS1的A984相邻区域，增加了IGFL2-AS1的稳定性。使用5 μM ActD。

K. dCas9 CRISPR-FTO系统与YTHDF2的结合：

dCas9 CRISPR-FTO结合sgRNA靶向IGFL2-AS1的A984相邻区域，将其从YTHDF2的结合位点解离。

要点：

pazopanib处理导致IGFL2-AS1的m6A修饰去甲基化和稳定化。

METTL14的敲低降低了IGFL2-AS1的m6A水平并增加了其表达。

dCas9 CRISPR-FTO系统通过靶向IGFL2-AS1的A984相邻区域增强了其表达，促进了AR和TWIST1的表达，促进了血管拟态的发展，并增加了IGFL2-AS1的稳定性，同时解离了其与YTHDF2的结合。

A. 一致性矩阵：

当k=3时，一致性矩阵显示三个聚类。

B. VM相关基因的表达模式热图：

热图展示了个体聚类中VM相关基因的表达模式。

C. 生存时间分析：

VM_high(聚类3)的患者比VM_low(聚类1)的患者生存时间更短。

D. IGFL2-AS1在ccRCC中的表达：

在VM_high亚型的ccRCC中，IGFL2-AS1过表达。

E. IGFL2-AS1在ccRCC和正常肾脏组织中的表达水平：

与正常肾脏组织相比，ccRCC中IGFL2-AS1的表达水平明显更高。

F. IGFL2-AS1在远处转移ccRCC中的表达：

与局部控制的ccRCC相比，远处转移的ccRCC中IGFL2-AS1的表达更高。

G. 生存分析：

Kaplan-Meier生存分析显示，IGFL2-AS1水平高的ccRCC患者比IGFL2-AS1水平低的患者总体生存期(OS)、无病生存期(DSS)和无进展间隔(PFI)更差。

H. 多因素Cox回归分析：

多因素Cox回归分析年龄、性别、TNM、T期、分级和IGFL2-AS1的影响。

I. IGFL2-AS1为基础的诺模图预测模型：

基于IGFL2-AS1的诺模图预测模型。

J. IGFL2-AS1和VM基因TWIST1的表达相关性：

在TCGA-KIRC中，IGFL2-AS1和VM基因TWIST1的表达水平高度相关。

要点：

IGFL2-AS1在ccRCC中过表达，与血管拟态(VM)的形成相关，并且表达水平高的患者预后较差。

IGFL2-AS1的表达与患者的生存期、肿瘤进展和远处转移相关。

IGFL2-AS1可以作为ccRCC患者预后的独立预测因子，并可能用于构建预测模型。

IGFL2-AS1与VM相关基因TWIST1的表达水平高度相关。

A. 肿瘤生长曲线：

接受指定治疗的帕唑帕尼耐药OSRC-2肿瘤的生长曲线。每两天腹腔注射10 mg/kg帕唑帕尼和35 mg/kg恩杂鲁胺。

B. 肿瘤图像：

从接受治疗的牺牲小鼠中获取的肿瘤图像。

C. 肿瘤重量：

接受治疗的牺牲小鼠的肿瘤重量。

D. CD31/PAS和Ki67染色分析：

指定肿瘤切片的CD31/PAS和Ki67染色分析。左侧为代表性图像;右侧为统计分析。标尺：100 μm。

E. 肿瘤生长曲线和肿瘤重量：

接受siNC(8 mg/kg)或siIGFL2-AS1(8 mg/kg)处理的帕唑帕尼耐药OSRC-2肿瘤的生长曲线(左)和肿瘤重量(右)。

F. 肿瘤图像：

接受siNC或siIGFL2-AS1处理的牺牲小鼠的肿瘤图像。

G. CD31/PAS和Ki67染色分析：

siNC或siIGFL2-AS1处理的肿瘤切片的CD31/PAS和Ki67染色分析。标尺：100 μm。

H. 统计分析：

G中CD31/PAS和Ki67染色分析的统计分析。

I. m6A介导的IGFL2-AS1/AR轴如何控制ccRCC中的VM发展和帕唑帕尼耐药性的示意图：

描述m6A介导的IGFL2-AS1/AR轴如何控制ccRCC中的血管拟态(VM)发展和帕唑帕尼耐药性的示意图。

要点：

研究评估了使用恩杂鲁胺或siRNA靶向IGFL2-AS1来抑制帕唑帕尼耐药的ccRCC进展。

使用恩杂鲁胺和siIGFL2-AS1处理可以抑制帕唑帕尼耐药的OSRC-2肿瘤的生长。

肿瘤的血管生成和增殖减少，这表明了治疗的疗效。

图中的示意图说明了m6A修饰如何通过IGFL2-AS1/AR轴影响ccRCC的VM发展和耐药性。

这些结果支持了在临床前研究中使用恩杂鲁胺或siRNA靶向IGFL2-AS1作为ccRCC治疗策略。

研究结论

IGFL2-AS1是一种带有m6A修饰的长编码RNA。

IGFL2-AS1通过METTL3/METTL14复合体去甲基化。

在慢性帕唑帕尼治疗过程中，由于YTHDF2的识别失败，IGFL2-AS1变得稳定。

IGFL2-AS1与雄激素受体(AR)mRNA的5'-UTR区域物理相互作用。

IGFL2-AS1中和了5'-uORF对AR翻译的负向调控。

使用恩杂鲁胺抑制AR活性或使用siRNA沉默IGFL2-AS1，都导致了帕唑帕尼耐药的透明细胞肾细胞癌(ccRCC)肿瘤生长的减缓。

体内异种移植小鼠模型验证了上述实验结果。