HBV细胞感染模型丨筛选易感HBV的HepG2-NTCP细胞亚型

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。

NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：HepG2-NTCP Subclones Exhibiting High Susceptibility to Hepatitis B Virus Infection.

中文标题：HepG2-NTCP亚克隆对乙肝病毒感染高度敏感

发表期刊：《Viruses》

影响因子：5.8

作者单位：

1.加拿大安大略省多伦多市多伦多总医院肝病中心，多伦多大学健康网络研究学院，多伦多，ON M5G 1L7

2.加拿大安大略省多伦多市多伦多大学免疫学系，多伦多，ON M5S 1A8

作者信息：Zahoor MA, Kuipery A, Mosa AI, Gehring AJ, Feld JJ.

研究背景

HepG2细胞在重构NTCP后，被广泛用作体外HBV复制感染的模型。然而，NTCP表达水平的失衡可能会影响HepG2细胞系中HBV的感染效率，进而影响实验结果的准确性。通过单细胞克隆技术，我们从HepG2-NTCP-A3亲本细胞中获取了多个对HBV感染具有更高易感性的亚克隆。其中，一些亚克隆(如HepG2-NTCP-A3/C2)的HBV感染率是亲本克隆的四倍以上。值得注意的是，在没有PEG的条件下，亚克隆C2仍保持了较高的HBV感染易感性，这表明HepG2-NTCP-A3亲本细胞内的功能异质性可以被用来建立无需PEG的HBV感染模型。尽管这些亚克隆表达了不同水平的NTCP，但它们的形态和细胞生长差异并不显著。这些发现表明，这些亚克隆提供了改进的HBV感染模型，并且为了减少HBV易感性的种内变异，应定期筛选亲本HepG2-NTCP亚种群。

研究方法

在本研究中，作者通过有限稀释法从HepG2-NTCP-A3亲本细胞中产生了多个HepG2-NTCP亚克隆。为了评估这些亚克隆的NTCP表达水平，作者采用RT-qPCR技术检测了亚克隆中NTCP和内参基因GAPDH的mRNA水平。此外，作者通过标记Myrcludex B来直接检测NTCP的蛋白表达。为了评估亚克隆对HBV的感染效率，作者使用感染HepAD38细胞收获的HBV，在存在或不存在PEG的条件下感染这些亚克隆，并通过定量PCR来测定HBV基因组的量。同时，作者通过免疫荧光技术检测了HBV核心蛋白的表达情况。最后，所有的统计分析均使用GraphPad Prism软件完成，以确保数据的准确性和可靠性。

实验结果

图1：HepG2-NTCP-A3亚克隆中的HBV感染情况。

(A) 用含有PEG8000的1000 GEq/mL HBV感染HepG2-NTCP-A3的指示亚克隆;收集细胞培养上清，并通过实时PCR量化HBV量。

(B) 感染HBV的HepG2-NTCP-A3亚克隆被固定并用HBcAg抗体进行免疫染色，然后用DAPI进行对比染色。细胞通过荧光显微镜观察。

(C) 以DAPI为基线的HBcAg荧光比率。数据以平均值±标准差表示(单因素方差分析;p < 0.0001;*表示显著水平)。

(D) HepG2-NTCP-A3亲本克隆或其亚克隆在有或无Myrcludex B(1 µM;MyrB)的情况下感染HBV。感染后四天，从感染细胞中提取DNA，并通过实时PCR量化与β-珠蛋白相对的cccDNA拷贝数。数据以平均值±标准差表示(双因素方差分析;p < 0.0001;*表示显著水平)。

(E) C2亚克隆和HepG2-NTCP-A3亲本克隆以100、200和500 MOI的感染复数感染HBV。感染后第四天收集上清进行DNA量化。

(F) 细胞被固定并用HBcAg抗体进行免疫染色，细胞核用DAPI对比染色。

(G) 以DAPI为基线的HBcAg荧光比率。数据以平均值±标准差表示(t检验;p < 0.005)。

(H) 从在含有或不含MyrB的条件下感染HBV的HepG2-NTCP-A3或HepG2-NTCP-A3/C2亚克隆中提取DNA，并通过实时PCR量化与β-珠蛋白相对的cccDNA拷贝数。数据以平均值±标准差表示(双因素方差分析;p < 0.0001;*表示显著水平)。

图2：HepG2-NTCP-A3亚克隆中的无PEG HBV感染情况

(A) 指定的HepG2-NTCP-A3亚克隆在无PEG条件下感染HBV，并通过实时定量PCR量化细胞培养上清中的HBV DNA量。

(B) 无PEG条件下感染HBV的细胞被固定并用HBcAg抗体进行免疫染色，然后用DAPI进行对比染色。细胞通过荧光显微镜观察。

(C) 以DAPI为基线的HBcAg荧光比率。数据以平均值±标准差表示(单因素方差分析;p < 0.0001，*表示显著水平)。

图3：C2亚克隆对HBV临床分离株的敏感性

(A)HepG2-NTCP-A3亲本克隆和C2亚克隆感染了三个经过序列确认的B型、C型和E型患者样本。感染后第七天收集上清，并通过实时PCR量化HBV DNA的量;

(B)感染HBV的细胞被固定并用HBcAg抗体进行免疫染色，然后用DAPI进行对比染色。细胞通过荧光显微镜观察;

(C)以DAPI为基线的HBcAg荧光比率。数据以平均值±标准差表示(t检验;p < 0.05，*表示显著水平)。

图4：HepG2-NTCP-A3细胞亚克隆中的NTCP表达

(A)稳定表达人NTCP的HepG2-NTCP-A3亲本克隆通过有限稀释法亚克隆到96孔板中。个别亚克隆被扩大并处理，以通过逆转录酶实时PCR进行NTCP mRNA的定量。将HepG2-NTCP-A3亲本克隆的NTCP表达水平设置为1，以表示倍数变化，并且数据以平均值±标准差表示(单因素方差分析;p < 0.0001;*表示显著水平);

(B)HepG2细胞、HepG2-NTCP-A3亲本克隆及其亚克隆B7、C2、D10、G4和G7使用标记了Alexa Fluor的Myrcludex B(MyrB-Alexa-647)进行细胞表面NTCP表达的染色，并通过荧光显微镜进行观察;

(C)细胞表面NTCP表达的定量表示为平均荧光强度(MFI);

(D)HepG2-NTCP-A3亲本克隆及其亚克隆B7、C2、D10、G4和G7中NTCP表达水平与HBV感染之间的Pearson相关系数。

研究结论

NTCP作为HBV的功能受体，其表达水平的任何变化都可能对HBV感染的结果和动力学产生影响。通过有限稀释法获得的多个HepG2-NTCP亚克隆对HBV的易感性存在差异，这表明HepG2-NTCP-A3亲本细胞实际上是由功能不同的表型组成的混合群体。NTCP表达的差异可能导致肝细胞对HBV感染性的降低，而HepG2-NTCP细胞中HBV感染性的增强则依赖于NTCP。尽管C2亚克隆的NTCP表达水平显著高于亲本HepG2-NTCP-A3，但其他亚克隆的NTCP表达水平与HBV易感性之间的关系并不一致，这提示可能存在其他细胞因子参与调控HBV的进入或复制。聚乙二醇(PEG)的添加增强了所有克隆的HBV感染，但C2亚克隆在没有PEG的条件下仍能维持较高的HBV感染率。C2亚克隆在有无PEG的情况下都能支持HBV感染，这可能为进一步减少对PEG的依赖提供一个重要的进步。此外，C2亚克隆不仅能增强对培养获得的HBV基因型D的感染，还能增强对基因型B和E的患者源性HBV样本的感染。因此，为了研究HBV的生命周期，应定期监测表达NTCP的肝癌细胞系中NTCP的表达水平或HBV的易感性。