PRMT5通过VP1的精氨酸甲基化促进传染性法氏囊病病毒复制

基本信息

英文标题：PRMT5 Facilitates Infectious Bursal Disease Virus Replication through Arginine Methylation of VP1.

中文标题：PRMT5通过VP1的精氨酸甲基化促进传染性法氏囊病病毒复制

发表期刊：《Journal of Virology》

影响因子：5.4

作者单位：江西农业大学、 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

作者信息：Xifeng Hu，Zheng Chen，Xiangdong Wu，Qiuling Fu，Zhen Chen，Yu Huang，Huansheng Wu.

研究背景

传染性法氏囊病病毒(IBDV)的聚合酶VP1蛋白负责转录、初始翻译和病毒基因组复制。了解VP1的新类型翻译后修饰有助于识别针对该病毒的新药物。

研究方法

本研究通过细胞培养、病毒感染、免疫共沉淀、质谱分析、转染、基因敲除、病毒复制和聚合酶活性检测等方法，探讨了PRMT5对IBDV VP1的精氨酸甲基化作用及其对病毒复制的影响。

实验结果

图1：传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP1 是一种对称性二甲基精氨酸(sDMA)修饰的蛋白质

蛋白质修饰：传染性法氏囊病病毒(IBDV)的 VP1 蛋白质被对称性二甲基精氨酸(sDMA)修饰。

细胞转染：293T 细胞被瞬时转染了带有 Flag 标签的 VP1 蛋白质。

免疫共沉淀：通过抗 Flag 亲和素琼脂糖对 Flag-VP1 进行免疫共沉淀(IP)。

Western blot 分析：IP 后的蛋白质复合物用 Western blot 方法进行分析。

病毒感染细胞：DF-1 细胞感染了 IBDV。

感染时间：感染后 12 小时，对细胞进行 IP 和 Western blot 分析。

抗体使用：在免疫印迹(IB)分析中使用了特定的抗体来检测 VP1 蛋白。

图2：PRMT5 与 VP1 相互作用

蛋白质相互作用：PRMT5 蛋白与 VP1 蛋白存在相互作用。

免疫共沉淀：使用 Flag 标签和抗 Flag 亲和素琼脂糖进行 VP1 的免疫共沉淀。

质谱分析：通过质谱分析确定了与 VP1 相互作用的宿主蛋白，包括 PRMT5。

肽段覆盖率：确定了 PRMT5 蛋白上鉴定出的肽段的覆盖率。

蛋白质序列定位：在 PRMT5 序列中定位了特定的肽段。

Western blot 分析：对 293T 细胞和 DF-1 细胞的全细胞裂解物及 IP 复合物进行了 Western blot 分析。

蛋白质相互作用验证：通过 GST 和 His 标签的融合蛋白验证了 PRMT5 与 VP1 的相互作用。

突变体分析：使用 PRMT5 的 R375A 突变体来研究其对 VP1 相互作用的影响。

β-肌动蛋白对照：使用 β-肌动蛋白作为上样对照来确保 Western blot 分析的加载量一致。

图3：图例(续)反转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)分析(B)

RT-qPCR 分析：使用反转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)对病毒 RNA 进行分析。

亚细胞蛋白质提取：感染不同时间的细胞进行亚细胞蛋白质提取并进行 Western blot 分析。

PRMT5 表达量化：通过 ImageJ 软件量化 Western blot 中 PRMT5、β-肌动蛋白和 H3 的密度。

免疫荧光测定：通过免疫荧光测定(IFA)和显微镜扫描观察 PRMT5 和 VP1 在细胞中的分布。

病毒蛋白表达分析：通过 RT-qPCR 和 Western blotting 分析病毒 RNA 和主要病毒蛋白(VP1/2/3)的表达。

病毒滴度测定：通过 50% 组织培养感染剂量(TCID50)测定法检测细胞病毒滴度。

统计数据分析：实验数据以平均值 ± 标准偏差(SD)表示，并进行显著性差异分析。

图4：PRMT5 抑制剂抑制病毒复制

抑制剂浓度测试：测试了不同浓度的 HLCL-61 对 DF-1 细胞活力的影响。

时间梯度处理：用 4 mg/mL HLCL-61 对细胞进行不同时间处理，并通过 Western blot 分析其影响。

VP1 转染与处理：将 Flag-VP1 转染入 DF-1 细胞，并在收获前用 HLCL-61 处理，接着进行 IP 和 Western blot 分析。

病毒感染与表达分析：处理后的细胞感染 IBDV，分析病毒 RNA 和主要蛋白的表达。

病毒滴度检测：通过 TCID50 测定法检测经 HLCL-61 处理的细胞感染 IBDV 后的病毒滴度。

数据分析：通过 ImageJ 软件量化 Western blot 中的蛋白密度，并通过统计分析确定实验结果的显著性。

图5：PRMT5 的敲除抑制病毒增殖

T7E1 分析：对 sgRNA1 和 sgRNA2 的 PCR 产物进行 T7E1 分析，以检测 PRMT5 基因的编辑效果。

Western blot 分析：通过 Western blot 分析 PRMT5 敲除的 DF-1 细胞裂解物中的 PRMT5 蛋白。

PCR 产物插入与序列比对：将 PRMT5 敲除细胞的 PCR 产物插入到 pMD18T 载体中，并进行序列比对。

敲除细胞传代与 Western blot：PRMT5 敲除细胞经过多次传代后，使用 Western blot 分析 PRMT5 蛋白的表达。

病毒感染与分析：野生型和 PRMT5 敲除的 DF-1 细胞感染 IBDV 后，分析病毒基因组水平和主要蛋白 VP1/2/3 的表达。

病毒滴度测定：通过 TCID50 测定法检测不同时间点感染 IBDV 的细胞病毒滴度。

数据分析与显著性检验：通过 ImageJ 软件量化 Western blot 中的蛋白密度，并通过统计分析确定实验结果的显著性。

图6：VP1 的精氨酸 426(R426)是 PRMT5 介导的对称二甲基化(sDMA)位点

共转染与免疫共沉淀：将质粒共转染入 293T 细胞，并通过免疫共沉淀(IP)分析 VP1 和 PRMT5 的相互作用。

蛋白质纯化与质谱分析：从转染的 DF-1 细胞中纯化 Flag-VP1，并通过液相色谱-质谱(LC-MS)分析其肽段。

质谱数据描述：描述了通过 LC-MS 鉴定的 VP1 肽段的信息。

质谱图展示：展示了鉴定出的 VP1 肽段的质谱图。

IP 与 Western blot 分析：在 293T 细胞和 prmt5 敲除的 DF-1 细胞中，使用抗 Flag 亲和素琼脂糖进行 IP，并对 IP 复合物和细胞裂解物进行 Western blot 分析。

体外甲基化反应：将特定蛋白质混合进行体外精氨酸甲基化反应，并通过 Western blotting 分析结果。

VP1聚合酶结构：展示了 VP1 聚合酶的结构示意图，指出 R426 位点在 IBDV 中的保守性以及聚合酶活性所需的 Mg21 结合位点。

图7：VP1 的精氨酸甲基化有助于其聚合酶活性

聚合酶活性评价系统：建立了评价 VP1 聚合酶活性的系统。

蛋白质表达分析：通过 Western blotting 分析了 VP1、VP2 和 VP3 蛋白的表达。

精氨酸甲基化影响：分析了 WT 和 prmt52/2 DF-1 细胞中 VP2 蛋白的表达，以及 HLCL-61 处理对 VP2 表达的影响。

病毒感染与蛋白质分析：分析了感染 IBDV 后的 WT 和 prmt52/2 DF-1 细胞中主要病毒蛋白的表达。

病毒基因组分析：通过 RT-qPCR 分析了感染 IBDV 后的细胞中病毒基因组的变化。

数据统计与显著性：通过 ImageJ 软件量化 Western blot 数据，并通过统计分析确定实验结果的显著性。

图8：R426 突变体降低病毒复制

病毒拯救系统：建立了用于拯救 IBDV 的双启动子系统。

细胞病变效应观察：观察了 WT IBDV 和 R426A IBDV 感染 DF-1 细胞后的细胞病变效应(CPE)。

病毒滴度检测：通过 TCID50 测定法检测了 293T 细胞上清中的 IBDV 滴度。

病毒基因组与蛋白质表达分析：通过 RT-qPCR 分析了病毒基因组水平，并通过 Western blot 分析了 VP1、VP2 和 VP3 蛋白的表达。

VP1/2/3 表达量化：量化了 Western blot 中 VP1/2/3 蛋白的表达密度。

病毒复制抑制：分析了 R426A 突变体对 IBDV 复制的影响，发现突变体降低了病毒滴度。

数据统计与显著性：通过统计分析确定实验结果的显著性，并呈现了三个独立实验的平均值 ± 标准偏差(SD)。

研究结论

甲基化位点鉴定：研究发现 IBDV 的 VP1 蛋白在精氨酸 426 位点(R426)被 PRMT5 特异性甲基化。

PRMT5 的细胞内积累：IBDV 感染导致 PRMT5 在细胞质中积累，并与 VP1 共定位形成斑点状结构。

PRMT5 过表达对病毒复制的影响：PRMT5 的过度表达显著增强了病毒复制。

R426 位点突变的影响：在 PRMT5 存在的情况下，VP1 的聚合酶活性在 R426 位点突变为丙氨酸后受到严重破坏。

病毒复制受损：VP1 R426 位点的突变导致病毒复制受损，表明 R426 位点的甲基化对病毒复制至关重要。