南大学医学院等联合发表：东Semaphorin 3C（Sema3C）重塑肿瘤基质微环境，促进肝细胞癌进展

基本信息

英文标题：Semaphorin 3C (Sema3C) reshapes stromal microenvironment to promote hepatocellular carcinoma progression

中文标题：Semaphorin 3C(Sema3C)重塑肿瘤基质微环境，促进肝细胞癌进展

发表期刊：《Signal transduction and targeted therapy》

影响因子：40.8

作者单位：东南大学医学院

作者信息：Hao Peng;Meng Yang;Kun Feng;Qingpeng Lv;Yewei Zhang

研究背景

1. 背景

HCC特点：90%以上HCC病例发生在纤维化或肝硬化背景下，肿瘤微环境(TME)涉及CAFs和CSCs的相互作用。

研究问题：CSCs如何调控HCC基质动态的机制尚不明确。

2. 主要发现

Sema3C作用：

在纤维化肝脏、HCC组织、患者外周血及索拉非尼耐药组织中显著上调，与HCC干性特性相关。

通过NRP1和ITGB1受体激活AKT/Gli1/c-Myc通路，增强HCC自我更新和肿瘤起始。

促进ECM收缩、胶原沉积及HSCs增殖和活化。

通过NF-kB通路刺激IL-6释放和HMGCR表达，增强HSCs胆固醇合成。

CAFs作用：

CAF分泌的TGF-β1激活AP1信号，增强HCC细胞中Sema3C表达，形成正反馈环路。

CAFs通过促进肿瘤细胞增殖、血管生成和重塑微环境支持肿瘤发生，并通过破坏药物传递和信号传导促进化疗耐药。

3. 机制

Sema3C与HSCs：通过NRP1和ITGB1激活NF-kB通路，促进IL-6释放和胆固醇合成。

CAF与HCC细胞：通过TGF-β1/AP1信号增强Sema3C表达，加速HCC进展。

4. 治疗潜力

Sema3C阻断：抑制肿瘤生长，增强HCC细胞对索拉非尼的敏感性。

治疗策略：Sema3C作为CSCs与基质相互作用的新靶点，为HCC治疗提供新方向。

研究方法

1. 细胞系与细胞培养

细胞系来源：肝癌细胞系(Hep3B、Huh7、MHCC-97L、HepG2、SMMC7721)和人肝星状细胞系(LX-2)均从商业公司购买。

CAF(癌相关成纤维细胞)分离：从新鲜肝癌组织中分离CAF，通过胶原酶和透明质酸酶消化组织，过滤后离心，使用含10% FBS的培养基培养，最终获得CAF。

条件培养基(CM)收集：将CAF或肝癌细胞接种于6孔板，替换为无血清培养基，培养48小时后收集上清液，离心去除细胞碎片。

2. 临床样本与公共数据库

血清样本：从肝癌患者术前外周血和健康个体中分离血清。

肝癌组织样本：从南京医科大学第二附属医院收集肝癌切除患者的组织样本，所有患者均未接受化疗或放疗。

公共数据库：从TCGA、HCCDB和GEO数据库获取肝癌基因表达数据和临床数据，用于分析Sema3C的表达。

3. 病毒构建与RNA干扰

慢病毒构建：构建过表达Sema3C的慢病毒，合成针对Sema3C和ITGB1的shRNA载体。

siRNA设计：设计并合成针对Sema3C、NRP1、c-Jun、c-Fos和ITGB1的siRNA，使用Lipofectamine 2000转染细胞。

4. RNA提取与qRT-PCR

RNA提取：使用TRIZOL试剂提取细胞RNA，合成cDNA后进行qRT-PCR，使用SYBR Green检测基因表达，以GAPDH为内参。

5. 蛋白质分析

Western Blot：使用RIPA缓冲液裂解细胞，离心后测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳，转膜后使用一抗和二抗检测目标蛋白。

ELISA：使用ELISA试剂盒检测细胞上清液中Sema3C、TGF-β1和IL-6的浓度。

6. 细胞功能实验

细胞增殖与凋亡：通过CCK-8实验检测细胞活力，使用Annexin-V/PI染色检测细胞凋亡。

球体形成实验：将肝癌细胞接种于超低附着板，培养7-10天后计数球体数量。

Transwell迁移与侵袭实验：将细胞接种于Transwell小室，分别进行迁移和侵袭实验，固定染色后计数迁移或侵袭的细胞数。

7. 胶原凝胶收缩实验

凝胶制备：将细胞悬液与胶原I混合，调整pH后转移至24孔板，待凝胶凝固后处理，测量凝胶收缩面积。

8. 免疫组织化学(IHC)与免疫荧光(IF)

IHC染色：将组织切片进行抗原修复，使用一抗和二抗染色，检测Ki67、p-AKT、Gli1、c-Myc、Sema3C等蛋白表达。

IF染色：固定细胞或组织切片，使用一抗和荧光标记的二抗染色，观察α-SMA和Collagen I的表达。

9. 染色质免疫共沉淀(ChIP)

ChIP实验：使用Simple ChIP试剂盒，将细胞交联后超声破碎DNA，使用抗体免疫沉淀，通过qRT-PCR分析Sema3C启动子区域的DNA富集。

10. 免疫共沉淀(Co-IP)与质谱分析

Co-IP实验：使用rProtein A/G磁珠，将细胞裂解后与抗体孵育，进行免疫沉淀，通过Western Blot分析目标蛋白。

质谱分析：将凝胶样品酶解后进行质谱检测，数据上传至ProteomeXchange数据库。

11. RNA测序分析

RNA提取与测序：使用TRIzol试剂提取LX-2细胞的RNA，通过illumina Novaseq平台进行RNA测序，使用Cufflinks进行差异基因表达分析。

12. 肝癌小鼠模型

模型建立：通过DEN和CCl4诱导C57BL/6小鼠肝癌模型，观察肿瘤形成。

联合治疗实验：使用rAAV8-shSema3C或rAAV8-shNC病毒注射小鼠，联合索拉非尼治疗，评估肿瘤生长抑制效果。

13. 体内致瘤性实验

实验流程：按照东南大学医学院动物伦理委员会指南进行实验，评估Sema3C对肝癌生长的体内影响。

实验结果

1. Sema3C的识别与表达分析

数据整合：通过整合公共数据集(GSE14323、GSE6764、GSE121153)识别出Sema3C在肝硬化和HCC中均上调，并与索拉非尼耐药相关。

病理分期相关性：Sema3C表达与HCC病理分期呈正相关。

外周血检测：ELISA检测显示HCC患者外周血中Sema3C表达显著高于健康个体(n=5)。

2. Sema3C与HCC预后的关系

生存分析：基于TCGA-LIHC数据集的Kaplan-Meier分析显示，高表达Sema3C的HCC患者总体生存率显著降低。

复发预测：基于GSE14520数据集的累积复发事件分析表明，高表达Sema3C与HCC复发风险增加相关。

3. Sema3C在HCC发展中的动态表达

qRT-PCR分析：在DEN+CCl4诱导的HCC模型中，Sema3C表达在正常肝脏(8周)、纤维化肝脏(16-19周)和HCC(22周)中逐渐上调。

免疫荧光染色：HCC组织(22周)中Sema3C与EpCAM共定位，表明其与HCC干细胞特性相关。

4. Sema3C与索拉非尼耐药的关系

耐药细胞表达：索拉非尼耐药的Huh7和HepG2细胞中，Sema3C的mRNA和蛋白表达显著高于敏感细胞。

非分化细胞表达：与非分化HCC细胞系相比，分化HCC细胞系中Sema3C表达显著上调(GSE36133数据库)。

5. Sema3C与干细胞相关基因的相关性

相关性分析：HCCDB数据集分析显示，Sema3C表达与HCC中多个干细胞相关基因(如OCT4、SOX9)显著正相关。

EpCAM+细胞表达：GSE5975数据库中，EpCAM+细胞的Sema3C表达显著高于EpCAM-细胞。

6. Sema3C与干细胞标志物的生存分析

OCT4+和SOX9+表达：基于TCGA-LIHC数据集的Kaplan-Meier分析显示，高表达Sema3C且OCT4+或SOX9+的HCC患者总体生存率显著降低。

1. Sema3C的表达分析

细胞系表达：通过Western印迹法检测多种肝细胞癌细胞系、肝星状细胞(LX-2)和正常肝细胞(MIHA)中Sema3C的蛋白表达水平。

过表达与敲低：通过Western印迹法验证Sema3C过表达和敲低的肝细胞癌细胞中Sema3C的蛋白表达水平。

2. Sema3C与干细胞特性的关系

球状体表达：通过qRT-PCR分析，HepG2和Huh7细胞球状体中Sema3C的mRNA表达显著高于非球状体细胞。

干细胞相关基因：Sema3C过表达的肝细胞癌细胞中，与干细胞特性相关的基因(如OCT4、SOX2、NANOG)mRNA表达显著上调。

3. Sema3C对化疗耐药的影响

MTT试验：Sema3C过表达增强肝细胞癌细胞的化疗耐药性，而Sema3C敲低则降低耐药性。

4. Sema3C对自我更新的影响

球体形成试验：Sema3C过表达显著促进肝细胞癌细胞的自我更新能力，而Sema3C敲低则抑制自我更新。

5. Sema3C对肿瘤起始的影响

限制稀释试验：在BALB/c裸鼠中，Sema3C敲低的HepG2细胞(shSema3C)肿瘤起始能力显著降低，而Sema3C过表达的Hep3B细胞(OE-Sema3C)肿瘤起始能力显著增强(每组n=5)。

统计分析：使用Student's t检验比较两组，并通过极端限制稀释分析(ELDA)进行限制稀释试验。

1. Sema3C与信号通路的关联

KEGG通路分析：基于TCGA-LIHC数据库，Sema3C与肝细胞癌患者中的PI3K-AKT信号通路高度相关。

GSEA分析：在高表达Sema3C的肝细胞癌组中，PI3K/AKT和Hedgehog信号通路相关基因显著富集。

2. Sema3C对信号分子的影响

β-catenin和YAP水平：Sema3C过表达的MHCC-97L细胞中，β-catenin和磷酸化YAP水平显著上调(Western blot分析)。

mRNA表达：Sema3C过表达的MHCC-97L细胞中，Gli1、Gli2、c-Myc和CCND1的mRNA表达显著上调;Sema3C敲低的HepG2细胞中，这些基因的表达显著下调。

蛋白表达：Sema3C过表达的MHCC-97L和HepG2细胞中，总AKT、p-AKT、Gli1和c-Myc的蛋白表达水平显著上调。

3. AKT抑制剂的作用

细胞活力：用AKT抑制剂MK2206处理的Sema3C过表达的Hep3B和MHCC-97L细胞，细胞活力显著降低(MTT实验)。

自我更新能力：MK2206处理显著抑制Sema3C过表达细胞的球状体形成能力(球状体形成实验)。

信号分子水平：MK2206处理显著降低Sema3C过表达细胞中Gli1、p-AKT和c-Myc的蛋白水平(Western blot分析)。

4. 体内实验验证

异种移植肿瘤染色：HepG2异种移植肿瘤的H&E和IHC染色显示，Sema3C敲低显著降低Ki67、c-Myc、p-AKT(Ser473)和Gli1的表达。

1. Sema3C与NRP1和ITGB1的相互作用

受体识别方案：通过实验方案识别出Sema3C和NRP1的潜在结合受体。

共免疫沉淀分析：在Huh7细胞中验证ITGB1是Sema3C或NRP1的结合蛋白。

敲低实验：在Huh7细胞中敲低NRP1和ITGB1后，通过共免疫沉淀检测Sema3C、NRP1和ITGB1之间的相互作用。

2. ITGB1的表达与干细胞特性

表达检测：在Sema3C过表达或敲低的HCC细胞中检测ITGB1的表达。

相关性分析：HCCDB数据集分析显示，ITGB1表达与HCC中多个干细胞相关基因显著正相关。

3. ITGB1敲低的功能验证

蛋白表达：通过蛋白质印迹法验证ITGB1敲低的Huh7细胞中ITGB1的表达水平。

化疗耐药性：ITGB1敲低显著降低Huh7细胞的化疗耐药性(MTT试验)。

自我更新能力：ITGB1敲低显著抑制Huh7细胞的自我更新能力(球形成试验)。

4. Sema3C过表达与ITGB1敲低的联合效应

化疗耐药性：Sema3C过表达增强Huh7细胞的化疗耐药性，而ITGB1敲低逆转这一效应(MTT试验)。

自我更新能力：Sema3C过表达促进Huh7细胞的自我更新能力，而ITGB1敲低抑制这一能力(球形成试验)。

信号分子水平：Sema3C过表达上调Gli1、p-AKT和c-Myc的蛋白表达，而ITGB1敲低逆转这一效应(蛋白质印迹法)。

5. 体内实验验证

限制稀释试验：在BALB/c裸鼠中，ITGB1敲低的Huh7细胞(shITGB1)肿瘤起始能力显著降低(每组n=5)。

6. 临床相关性

生存分析：基于Sema3C+NRP1+ITGB1高或低基因特征的Kaplan-Meier生存分析显示，高表达组HCC患者的总体生存率显著降低。

1. Sema3C与ECM重塑和HSCs激活的关联

GO分析：基于与Sema3C和NRP1结合的交集蛋白进行GO分析，揭示Sema3C在ECM重塑和HSCs激活中的潜在功能。

2. Sema3C对胶原凝胶收缩的影响

凝胶收缩试验：过表达Sema3C的MHCC-97L细胞上清液显著促进胶原凝胶收缩，表明Sema3C参与ECM重塑。

3. Sema3C对原位肝异种移植肿瘤的影响

组织染色：注射MHCC-97L-OE-Sema3C细胞的裸鼠原位肝异种移植肿瘤中，H&E染色、Masson三色染色、Picrosirius红染色及α-SMA和I型胶原的免疫组化染色显示，Sema3C过表达显著增加胶原纤维和α-SMA的比例(n=5)。

4. Sema3C对HSCs的激活作用

免疫荧光染色：HSCs用rhSema3C或过表达Sema3C的上清液处理后，α-SMA和I型胶原的表达显著上调。

Western blot分析：LX-2细胞用rhSema3C或过表达Sema3C的上清液处理后，α-SMA表达水平显著增加。

TGF-β1分泌：ELISA测定显示，Sema3C处理显著增加HSCs中TGF-β1的分泌。

5. Sema3C对HSCs功能的影响

化疗耐药性：MTT试验显示，Sema3C处理显著增强HSCs的化疗耐药性。

迁移和侵袭能力：Transwell试验表明，Sema3C处理显著促进HSCs的迁移和侵袭能力。

6. Sema3C对肿瘤生长的影响

异种移植肿瘤实验：将Hep3B细胞或过表达Sema3C的Hep3B细胞单独或与LX-2细胞混合注射到裸鼠体内，32天后Sema3C过表达组肿瘤重量和体积显著增加(每组n=5)。

1. Sema3C对HSCs基因表达的影响

火山图分析：LX-2细胞用rhSema3C处理后，差异表达基因显著变化，揭示了Sema3C对HSCs的广泛调控作用。

2. Sema3C对IL-6和IL-8的调控

mRNA水平：rhSema3C或Sema3C过表达的MHCC-97L细胞上清液处理HSCs后，IL6和IL8的mRNA水平显著上调(qRT-PCR检测)。

分泌水平：ELISA检测显示，rhSema3C处理显著增加HSCs中IL6的分泌。

3. Sema3C与NF-κB信号通路的关联

GSEA分析：在rhSema3C处理的LX-2细胞中，NF-κB通路相关基因显著富集。

蛋白表达：Western blotting显示，rhSema3C处理显著增加LX-2细胞中磷酸化p65和总p65的蛋白表达水平。

4. NF-κB抑制剂的作用

蛋白表达：用NF-κB抑制剂Bay 11-7082预处理的LX-2细胞，rhSema3C刺激后磷酸化p65、总p65和α-SMA的表达水平显著降低(Western blotting)。

IL6分泌：Bay 11-7082预处理显著抑制rhSema3C诱导的IL6分泌(ELISA检测)。

5. Sema3C与NRP1和ITGB1的相互作用

共免疫沉淀：LX-2细胞用OE-Sema3C-Hep3B细胞上清液处理后，ITGB1和NRP1之间的相互作用显著增强(Co-IP检测)。

IL6分泌：转染siNRP1的LX-2细胞，rhSema3C刺激后IL6分泌显著减少(ELISA检测)。

蛋白表达：转染siNRP1的LX-2细胞，rhSema3C刺激后磷酸化p65、总p65、α-SMA和HMGCR的表达水平显著降低(Western blotting)。

6. ITGB1的作用

蛋白表达：LX-2细胞用rhSema3C或Sema3C过表达的HCC细胞上清液处理后，ITGB1蛋白表达水平显著上调(Western blotting)。

IL6分泌：转染siITGB1的LX-2细胞，rhSema3C刺激后IL6分泌显著减少(ELISA检测)。

蛋白表达：转染siITGB1的LX-2细胞，rhSema3C刺激后磷酸化p65、总p65和α-SMA的表达水平显著降低(Western blotting)。

7. Sema3C对HSCs功能的影响

TGF-β1分泌：LX-2细胞分别用siNRP1、siITGB1或rhSema3C处理后，TGF-β1的分泌水平显著变化(ELISA检测)。

化疗耐药性：MTT测定显示，rhSema3C处理显著增强LX-2细胞的化疗耐药性。

迁移和侵袭能力：Transwell测定表明，rhSema3C处理显著促进LX-2细胞的迁移和侵袭能力。

1. Sema3C与CAF相关基因的关联

相关性分析：基于HCCDB数据集，Sema3C表达与CAF相关基因(如ACTA2、VIM、FAP、PDGFRB、S100A4)及胶原相关基因(如COL1A1、COL1A2、FLNA、ELN、LOX)显著正相关。

2. Sema3C与间质浸润的关系

免疫荧光染色：在HCC组织或DEN+CCl4诱导的小鼠肝组织中，高Sema3C表达与高程度间质浸润(α-SMA标记)显著相关。

临床相关性：HCC患者中，高Sema3C表达与间质百分比呈正相关(总n=27)。

3. Sema3C与HCC分期的关系

TCGA-LIHC分析：FAP高/Sema3C高的HCC患者与更晚期的T分期和疾病阶段显著相关。

4. CAF条件培养基对Sema3C表达的影响

Western blotting：CAF条件培养基(CAFs-CM)处理显著增加HCC细胞中Sema3C的表达。

5. Sema3C基因启动子的调控机制

AP1结合位点：Sema3C基因启动子中包含AP1(c-Jun/c-Fos)转录结合位点。

siRNA敲低：转染si-c-Fos或si-c-Jun的MHCC-97L和Huh7细胞中，Sema3C表达显著降低(Western blotting验证)。

ChIP-qPCR分析：TGF-β1刺激促进磷酸化c-Jun(p-c-Jun)和磷酸化c-Fos(p-c-Fos)与Sema3C基因启动子的结合。

6. TGF-β1对Sema3C表达的调控

Western blotting：不同浓度TGF-β1处理的MHCC-97L和Huh7细胞中，Sema3C、p-c-Jun、总c-Jun、p-c-Fos和总c-Fos的表达水平显著上调。

抑制剂作用：galunisertib(TGF-β1受体I抑制剂)和TGF-β1中和抗体(anti-TGF-β1)显著抑制TGF-β1诱导的Sema3C表达和AP1信号激活。

1. 实验设计与模型

HCC模型：采用DEN+CCl4诱导的小鼠HCC模型，并设计了治疗模式的时间点。

2. Sema3C表达检测

Western blotting：在26周后，从小鼠各组中取出肝脏，检测Sema3C的蛋白表达水平。

3. 肝脏表型分析

肝脏图像：26周时各组小鼠肝组织的代表性图像(每组n=5)。

肝/体重比：计算并比较各组小鼠的肝/体重比。

肿瘤数量：统计各组小鼠肝脏中的肿瘤数量。

肿瘤最大尺寸：测量并比较各组小鼠肝脏中肿瘤的最大尺寸。

4. 生存分析

Kaplan-Meier生存曲线：分析并展示各组小鼠的整体存活率百分比(n=8)。

5. 组织学与免疫组化分析

H&E染色：对4个治疗组收获的HCC肿瘤进行H&E染色。

IHC染色：对HCC肿瘤中的Ki67、Collagen I和EpCAM进行免疫组化染色，并进行统计分析(每组n=5)。

6. 机制示意图

Sema3C介导的相互作用：示意图展示了Sema3C在HCC中CSCs与基质之间的相互作用。

研究结论

Sema3C的作用：

1.在纤维化肝脏、HCC组织、HCC患者外周血以及索拉非尼耐药组织和细胞中显著上调。

2.过表达与HCC干性特性的获得相关。

3.通过NRP1和ITGB1受体激活AKT/Gli1/c-Myc信号通路，增强HCC自我更新和肿瘤起始。

4.促进细胞外基质(ECM)收缩和胶原沉积，刺激肝星状细胞(HSCs)的增殖和激活。

5.通过激活NF-kB信号通路，刺激IL-6释放和HMGCR表达，增强HSCs中的胆固醇合成。

CAFs的作用：

1.CAF分泌的TGF-β1激活AP1信号，增强

HCC细胞中Sema3C的表达，形成正反馈环路，加速HCC进展。

2.CAFs通过直接刺激肿瘤细胞增殖、促进血管生成和重塑微环境支持肿瘤发生。

3.CAFs通过破坏药物传递和生化信号促进化疗耐药。