LncRNA fam13a-AS1通过靶向miR-141-3p上调NEK6表达促进肾癌发生

基本信息

英文标题：LncRNA fam13a-AS1 promotes renal carcinoma tumorigenesis through sponging miR-141-3p to upregulate NEK6 expression.

中文标题：LncRNA fam13a-AS1通过靶向miR-141-3p上调NEK6表达促进肾癌发生

发表期刊：《Frontiers in Molecular Biosciences》

影响因子：5

作者单位：厦门大学医学院附属中山医院泌尿外科、福建医科大学第三临床医学院

作者信息：Xin Jun Wang,Si Li,Jiang Fang,Zhi Jian Yan,Guang Cheng Luo.

研究背景

肾细胞癌(RCC)是最常见且致死率高的泌尿生殖系统癌症之一。尽管局部RCC可以通过手术切除、放疗或局部消融治疗，但超过30%的患者最终会发展为转移性癌症，需要更复杂的治疗且预后不佳。因此，开发更好的风险评估、诊断和预后模型对于管理RCC变得迫切，这需要对疾病的分子机制有基本的理解。

研究方法

通过分析TCGA队列中539名RCC患者的基因表达资料和40名独立队列中的RCC患者，识别出FAM13A-AS1这一在RCC患者中上调的长非编码RNA。

利用敲除实验揭示FAM13A-AS1通过与miR-141-3p相互作用促进细胞增殖、迁移和侵袭。

通过克隆、转染、RNA提取、逆转录、实时定量PCR、西方印迹、MTT实验、侵袭和迁移实验、荧光素酶报告基因检测、细胞周期分析、荧光原位杂交(FISH)、动物模型建立和TCGA数据处理等方法进行研究。

实验结果

图1. FAM13A-AS1在肾细胞癌(RCC)中上调，并与不良临床结局相关。

(A) 点状图展示了来自TCGA队列的肾细胞癌(n = 539)和正常组织(n = 72)中FAM13A-AS1的表达水平。

(B) 点状图展示了来自我们队列的肾细胞癌(n = 40)和正常组织(n = 40)中FAM13A-AS1的表达水平。

(C) 条形图显示了在人类肾脏上皮细胞和癌细胞系中FAM13A-AS1表达的倍数变化。

(D) 通过Kaplan-Meier分析，展示了根据TCGA-KIRC队列中515名肾细胞癌患者FAM13A-AS1高表达和低表达分组后的总生存率。

要点：

FAM13A-AS1在肾细胞癌中的表达水平上调。

FAM13A-AS1的表达水平与肾细胞癌患者的临床结局不良相关。

研究使用了来自TCGA队列和我们队列的数据进行分析。

通过Kaplan-Meier曲线展示了FAM13A-AS1表达水平与患者生存率之间的关系。

图2. FAM13A-AS1促进肾细胞癌(RCC)细胞增殖、迁移和侵袭。

(A) 条形图显示了针对FAM13A-AS1的shRNA敲低效率。表达水平通过RT-qPCR测量，并以18S rRNA的表达水平为基准进行校准。表达水平的变化与对照序列进行比较计算。

(B) 经过shFAM13A-AS1转染或对照序列处理的RCC细胞的MTT实验。(C,D) 经过shFAM13A-AS1或对照序列处理的RCC细胞周期分布的代表性行星图(C)和量化(D)。(C)中的X轴和Y轴分别代表DNA含量和细胞数量。

(E,F) 经过shFAM13A-AS1或对照序列处理的RCC细胞的Annexin V/PI双参数流式细胞术分析的点图(E)和条形图(F)。条形图(F)显示了发生凋亡的细胞百分比。

(G,H) 经过shFAM13A-AS1或对照序列处理的RCC细胞Transwell迁移实验的代表图像(G)和量化(H)。

(I,J) 经过shFAM13A-AS1或对照序列处理的RCC细胞Matrigel侵袭实验的代表图像(I)和量化(J)。

数据代表平均值 ± 标准差。**：p < 0.01; ***：p < 0.001; ****：p < 0.0001。

要点：

FAM13A-AS1能够促进肾细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

通过shRNA敲低FAM13A-AS1，并使用RT-qPCR方法评估了敲低效率。

MTT实验用于评估增殖情况。

流式细胞术和Annexin V/PI染色用于分析细胞凋亡。

Transwell迁移实验用于评估细胞迁移能力。

Matrigel侵袭实验用于评估细胞侵袭能力。

所有实验数据均以平均值 ± 标准差表示，并进行了统计学显著性分析。

图3. FAM13A-AS1作为竞争性内源RNA(ceRNA)与miR-141-3p竞争结合。

(A,B) FISH实验(A)和RT-qPCR(B)显示了RCC细胞中FAM13A-AS1的亚细胞表达(核和细胞质)，以18S和U6作为内源对照。

(C) 韦恩图显示了计算机预测的FAM13A-AS1相互作用的miRNAs之间的交集。

(D) 点状图显示了miR-141-3p(Y轴)与TCGA队列中FAM13A-AS1(X轴)之间的共表达模式。

(E) 示意图显示了预测的miR-141-3p在FAM13A-AS1野生型转录本中的结合位点，以及FAM13A-AS1突变体逃避miR-141-3p结合的情况。红色核苷酸代表目标位点的突变。

(F) 条形图显示了RCC细胞共转染野生型(WT)或突变型(MUT) FAM13A-AS1质粒与miR-141-3p模拟物或阴性对照(ND)后的荧光素酶活性。

(G) 条形图显示了转染shFAM13A-AS1或阴性对照(ND)的RCC细胞中miR-141-3p的表达。表达水平通过RT-qPCR测量。

(H) 点状图显示了我们的队列中miR-141-3p(Y轴)与FAM13A-AS1(X轴)之间的共表达模式。

(I,J) 点状图显示了来自TCGA队列(H)和我们自己的队列(I)的RCC患者的正常和肿瘤组织中miR-141-3p的表达。

(K) 通过TCGA队列中的miR-141-3p表达对RCC患者总生存率的Kaplan-Meier分析。

数据代表平均值 ± 标准差。***：p < 0.001; ****：p < 0.0001。

要点：

FAM13A-AS1在RCC细胞中作为ceRNA，与miR-141-3p竞争结合。

使用FISH和RT-qPCR方法研究了FAM13A-AS1在细胞核和细胞质中的表达。

通过计算方法确定了与FAM13A-AS1相互作用的miRNAs。

在TCGA队列中研究了miR-141-3p与FAM13A-AS1的共表达模式。

预测了miR-141-3p在FAM13A-AS1野生型转录本中的结合位点，并研究了突变体对结合的影响。

通过荧光素酶报告实验验证了FAM13A-AS1与miR-141-3p的相互作用。

在我们的队列中验证了FAM13A-AS1和miR-141-3p之间的共表达关系。

分析了miR-141-3p在RCC患者正常和肿瘤组织中的表达。

通过aplan-Meier分析，研究了miR-141-3p表达水平与RCC患者总生存率的关系。

图4. miR-141-3p抑制肾癌细胞增殖、迁移和侵袭。

(A) 条形图显示了RCC细胞共转染shFAM13A-AS1或对照序列后，经miR-141-3p处理的miR-141-3p表达水平。

(B) RCC细胞转染shFAM13A-AS1后，分别用miR-141-3p抑制剂或阴性对照处理的MTT实验。

(C,D) RCC细胞增殖实验的代表图像(C)和量化(D)。EdU阳性细胞：绿色。细胞核：蓝色。(C,D) RCC细胞周期分布的代表性行星图(C)和量化(D)。(C)中的X轴和Y轴分别代表DNA含量和细胞数量。条形图(D)显示了不同细胞周期阶段细胞的百分比。

(E,F) RCC细胞的Annexin V/PI双参数流式细胞术分析的代表点图(E)和量化(F)。下方条形图显示了发生凋亡的细胞百分比。RCC细胞系转染了shFAM13A-AS1或对照序列，并经miR-141-3p抑制剂处理。

(G,H) RCC细胞转染或经miR-141-3p抑制剂处理后Transwell迁移实验的代表图像(G)和量化(H)。

(I,J) 上述细胞的Matrigel侵袭实验的代表图像(I)和量化(J)。

数据代表平均值 ± 标准差。***：p < 0.001; ****：p < 0.0001。

要点：

miR-141-3p能够抑制肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

通过共转染实验评估了miR-141-3p在RCC细胞中的表达水平。

使用MTT实验来评估细胞的增殖情况。

通过细胞增殖实验和细胞周期分析来研究细胞增殖和周期分布。

使用流式细胞术和Annexin V/PI染色来分析细胞凋亡。

通过Transwell迁移实验来评估细胞迁移能力。

通过Matrigel侵袭实验来评估细胞侵袭能力。

所有实验数据均以平均值 ± 标准差表示，并通过统计学分析确定了显著性差异。

图5. FAM13A-AS1通过吸附miR-141-3p来上调其靶标NEK6。

(A) 集合图显示了五组计算机预测的miR-141-3p靶基因之间的交集。

(B) 在TCGA队列和我们的队列中，NEK6与miR-141-3p或FAM13A-AS1表达之间的相关性。

(C) 示意图显示了预测的miR-141-3p在NEK6野生型3'UTR中的结合位点，以及突变型逃避miR-141-3p结合的情况。红色核苷酸代表目标位点的突变。

(D) 条形图显示了786-O和SN2-PM6细胞共转染野生型(WT)或突变型(MUT) NEK6质粒与miR-141-3p模拟物或阴性对照(ND)后的荧光素酶活性。

(E,F) 条形图(E)和印迹图像(F)显示了786-O和SN2-PM6细胞转染miR-141-3p模拟物或阴性对照(ND)后，通过RT-qPCR和西方印迹分析得到的NEK6的mRNA和蛋白质水平。

数据代表平均值 ± 标准差。**: p < 0.01; ***: p < 0.001; ****: p < 0.0001。

要点：

FAM13A-AS1能够吸附miR-141-3p，从而上调其靶基因NEK6的表达。

通过计算机分析确定了miR-141-3p的多个预测靶基因，并找到了它们之间的交集。

在TCGA队列和我们的队列中分析了NEK6与miR-141-3p或FAM13A-AS1表达的相关性。

预测了miR-141-3p在NEK6的3'UTR中的结合位点，并研究了突变型对结合的影响。

通过荧光素酶报告实验验证了NEK6与miR-141-3p的相互作用。

通过RT-qPCR和西方印迹分析研究了NEK6在转染miR-141-3p模拟物后的mRNA和蛋白质表达水平。

实验数据以平均值 ± 标准差表示，并通过统计学分析确定了显著性差异。

图6. RCC中NEK6表达水平的升高。

(A) 点状图显示了来自TCGA队列的肾细胞癌(n = 539)和正常组织(n = 72)中NEK6的表达。

(B) 点状图显示了来自我们队列的肾细胞癌(n = 40)和正常组织(n = 40)中NEK6的表达水平。

(C,D) 印迹图像(C)和量化(D)展示了我们队列中的肾细胞癌和正常组织中NEK6的蛋白质水平。

(E) 通过TCGA队列中的NEK6表达对肾细胞癌患者总生存率的Kaplan-Meier分析。

要点：

在肾细胞癌中NEK6的表达水平升高。

使用TCGA队列的数据，比较了肾细胞癌和正常组织中NEK6的表达水平。

使用我们自己的队列数据，进一步验证了肾细胞癌和正常组织中NEK6的表达水平。

通过蛋白质印迹分析，研究了NEK6在我们队列的肾细胞癌和正常组织中的蛋白质水平。

通过Kaplan-Meier分析，研究了NEK6表达水平与肾细胞癌患者总生存率之间的关系。

图7. NEK6负责FAM13A-AS1介导的细胞增殖、迁移和侵袭。

(A) 条形图显示了在786-O和SN12-PM6细胞中转染shFAM13A-AS1或阴性对照(shNC)，同时转染空载体或NEK6过表达质粒后NEK6的表达。表达水平通过RT-qPCR测量，表达变化倍数以对照序列为基准计算。

(B) 印迹图像显示了上述细胞中NEK6的蛋白质水平。

(C) 786-O和SN12-PM6细胞转染shFAM13A-AS1或阴性对照(shNC)，同时转染空载体或NEK6过表达质粒后的MTT实验。

(D–K) 代表性图像和量化数据展示了786-O和SN12-PM6细胞转染shFAM13A-AS1或阴性对照(shNC)，同时转染空载体或NEK6过表达质粒后的细胞周期分布流式细胞术分析(D,E)、Annexin V/PI双参数流式细胞分析(F,G)、Transwell迁移实验(H,I)和Matrigel侵袭实验(G,K)。

数据代表平均值 ± 标准差。*: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p < 0.001; ****: p < 0.0001。

要点：

NEK6是FAM13A-AS1介导的细胞增殖、迁移和侵袭的关键因子。

通过RT-qPCR和蛋白质印迹分析了NEK6在转染FAM13A-AS1干扰序列和NEK6过表达质粒后的表达水平。

使用MTT实验评估了细胞增殖情况。

通过流式细胞术分析了细胞周期分布和细胞凋亡情况。

通过Transwell迁移实验和Matrigel侵袭实验评估了细胞迁移和侵袭能力。

实验结果通过统计学分析确定了显著性差异。

图8. FAM13A-AS1在体内促进肿瘤生成。

(A-C) 通过将上述786-O细胞移植到裸鼠中构建了异种移植肿瘤模型，展示了代表性图像(A)、肿瘤体积的测量(B)和肿瘤重量(C)。

(D-F) 通过RT-qPCR，以18S rRNA或U6的表达水平为基准，展示了肿瘤中FAM13A-AS1(D)、miR-141-3p(E)和NEK6(F)的表达。表达变化倍数以对照序列为基准计算。

(G,H) 肿瘤组织蛋白质水平的印迹图像(G)和量化(H)(n = 6)。

数据代表平均值 ± 标准差。**: p < 0.01; ***: p < 0.001; ****: p < 0.0001。

要点：

FAM13A-AS1在体内实验中促进了肿瘤的生成。

使用786-O细胞在裸鼠中建立了异种移植肿瘤模型，并通过图像、体积测量和重量测量来评估肿瘤的生长情况。

通过RT-qPCR方法，研究了肿瘤组织中FAM13A-AS1、miR-141-3p和NEK6的表达水平。

通过蛋白质印迹分析，研究了肿瘤组织中蛋白质水平的变化。

实验数据以平均值 ± 标准差表示，并通过统计学分析确定了显著性差异。

研究结论

长非编码RNA在肿瘤发生中具有重要作用，但其在肾细胞癌中的具体作用和机制尚不清楚。

通过对TCGA队列和独立队列的RCC患者基因表达数据分析，发现FAM13A-AS1在RCC中表达上调。

FAM13A-AS1通过与miR-141-3p相互作用，促进RCC细胞的增殖、迁移和侵袭。

FAM13A-AS1通过诱骗miR-141-3p来调节NEK6的表达，与NEK6表达呈正相关。

研究揭示了FAM13A-AS1在RCC中的致癌作用，及其通过竞争性结合miR-141-3p促进肿瘤生成的机制。