立体定向放疗增强PD-1抗肿瘤免疫

同源异体小鼠肿瘤模型是免疫肿瘤学(I/O)研究中不可或缺的临床前模型，但它们对免疫检查点抑制剂(ICIs)的反应有限，这可能是由于它们的固有低免疫原性。为了解决这一问题，研究人员通过将鸡卵清蛋白(OVA)这一高度免疫原性的蛋白质表达到同源异体肿瘤细胞中，开发了新的免疫原性同源异体模型。这些模型，如CT26-OVA和B16-OVA，显示出比它们的亲本细胞系更慢的肿瘤生长速度，这可能是由于免疫介导的排斥反应。更重要的是，这些OVA表达的模型对ICIs，特别是抗PD-1治疗，表现出更高的敏感性，这表明它们在增强T细胞介导的免疫反应方面具有潜力。此外，通过过继T细胞转移实验，研究人员验证了这些模型中存在肿瘤特异性记忆T细胞。这些结果表明，OVA工具细胞不仅增强了对ICIs的反应，而且为临床前免疫治疗评估提供了新的、具有更高免疫原性的同源异体模型，这对于I/O研究具有重要的意义。

基本信息

英文标题：Stereotactic Radiation Therapy Augments Antigen-Specific PD-1-Mediated Antitumor Immune Responses via Cross-Presentation of Tumor Antigen.

中文标题：立体定向放射治疗通过肿瘤抗原的交叉呈递增强抗原特异性PD-1介导的抗肿瘤免疫反应。

发表期刊：《Cancer Immunology Research》

影响因子：8.2

作者单位：

1. 放射肿瘤学和分子辐射科学系，约翰霍普金斯大学医学院，马里兰州巴尔的摩。

2. 肿瘤学系，约翰霍普金斯大学医学院，马里兰州巴尔的摩。

3. 布雷迪泌尿学研究所，约翰霍普金斯大学医学院，马里兰州巴尔的摩。

4. 分子生物学和遗传学系，约翰霍普金斯大学医学院，马里兰州巴尔的摩。

作者信息：Andrew B， Sharabi,Christopher J.Nirsch,Christina M. Koche，Thomas R. Nirsch.

研究背景

近年来，放射治疗(XRT)的免疫调节效应引起了广泛关注，尤其是其与免疫治疗的协同作用。尽管已有研究指出这种协同作用，但临床前研究仍需进一步证实放疗诱导的免疫反应的抗原特异性，并阐明其与免疫治疗的潜在协同机制。利用小动物放射研究平台(SARRP)，研究人员探究了立体定向放射治疗(SRT)与抗PD-1检查点阻断免疫疗法结合时，对内源性抗原特异性免疫反应的诱导能力。通过对B16-OVA黑色素瘤和4T1-HA乳腺癌肿瘤进行影像引导的SRT，研究发现这种联合疗法能够促进抗原特异性T细胞和B细胞介导的免疫反应。当放疗与抗PD-1治疗或调节性T细胞(Treg)耗竭相结合时，其免疫刺激效果显著增强，改善了局部肿瘤控制。研究还发现放疗能够上调肿瘤相关抗原-MHC复合物，增强肿瘤引流淋巴结中的抗原交叉呈递，并促进T细胞向肿瘤的浸润。这些结果不仅证明了放疗能够启动内源性抗原特异性免疫反应，而且为临床上将放射治疗与PD-1阻断结合提供了额外的机制理论基础。该研究成果发表在《Cancer Immunology Research》杂志上，是2014年美国癌症研究协会(AACR)的重要成果之一。

研究方法

在本研究中，作者使用了包括C57BL/6、BALB/cJ和MHC class I knockout在内的多种小鼠品系进行实验，其中OT1-Rag knockout小鼠在室内繁殖。所有动物实验均在特定病原体自由设施中进行，并获得了约翰霍普金斯大学医学院动物护理和使用委员会的批准。实验涉及的细胞系包括MC38-OVA、B16-OVA黑色素瘤细胞、4T1-HA乳腺癌细胞和B3Z T细胞杂交瘤，这些肿瘤细胞系在使用前均经过了Mycoplasma检测和模型抗原表达的确认。我们采用了流式细胞术、细胞内细胞因子染色和细胞因子分析等技术，使用特定克隆的荧光标记抗体对来自脾脏、腹股沟淋巴结和肿瘤的单细胞悬液进行染色和分析。此外，通过B3Z实验评估了交叉呈递能力，将不同剂量辐射处理后的B16-OVA细胞与B3Z细胞或整个脾细胞共培养，并利用ELISA测定IL2浓度。我们还进行了细胞过继转移实验和CFSE标记，将OT1-Rag knockout小鼠的T细胞标记后注入小鼠体内，并通过流式细胞术进行分析。小鼠血清中的抗体通过Anti-Ovalbumin IgG1 Mouse EIA Kit进行分析。B16-OVA黑色素瘤和4T1-HA乳腺癌模型用于进行肿瘤生长实验，并制备肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。体内实验使用SARRP进行，对已形成可触及肿瘤的小鼠进行CT成像引导的定位和放射治疗。最后，使用Prism 5软件进行统计分析，采用未配对的双尾t检验，以P值小于0.05、0.01和0.001作为统计学显著性的标准。

实验结果

图1. 放射治疗增强B16-OVA黑色素瘤和MC38-OVA结直肠癌中肿瘤相关抗原的MHC呈递。

实验中，B16-OVA黑色素瘤细胞在辐射后48小时通过光学显微镜和流式细胞术(前向散射和侧向散射图)进行了观察。此外，通过流式细胞术分析了辐射后48小时的B16-OVA和MC38-OVA细胞培养物，使用特定的抗小鼠SIINFEKL/H-2Kb抗体进行染色，并记录了相应的流式细胞图和百分比数据。实验还包括了辐射细胞与同型对照、H-2Kb或SIINFEKL/H-2Kb抗体染色的直方图分析，以及辐射细胞使用抗小鼠FAS或CD40抗体染色的流式细胞图。这些实验重复了三次，每次都得到了相似的结果。

图2.放射治疗促进肿瘤抗原呈递和引流淋巴结中抗原特异性T细胞的增殖与激活。

放射治疗(XRT)增强了肿瘤抗原的细胞介导呈递，并导致引流淋巴结(DLN)中抗原特异性T细胞的增殖和激活增加。具体实验包括：A. B3Z细胞与脾细胞共培养16小时后，上清液中IL2的ELISA浓度，有无OVA肽段的不同浓度。B. 未处理(0 Gy)或辐射处理(10或20 Gy)的B16-OVA黑色素瘤细胞单独或与B3Z细胞或整个脾细胞作为APC共培养的上清液中IL2浓度;实验重复三次，结果相似(P < 0.05)。C. B3Z细胞有无脾细胞共培养，加入不同浓度的OVA肽段，或与未处理或辐射处理的B16-OVA细胞的无细胞条件培养基(CM)共培养后的上清液中IL2浓度。D. 从DLNs中采集的体外CFSE标记的OT1 T细胞的流式直方图和点图;三个独立实验的代表结果(每组n = 4)。E. OT1 T细胞中IFNg阳性率的变化(Student t test; P < 0.01)。F. 从非肿瘤携带或B16-OVA肿瘤携带小鼠，或CAG-OVA小鼠(通过β-actin启动子持续表达OVA)中分离的体外CD11b+CD11c+ DCs的点图;三个独立实验的代表结果。G. 从未处理或辐射处理的MHC Class I knockout小鼠(携带B16-OVA肿瘤)中采集的体外CFSE标记的OT1 T细胞的流式直方图和点图;实验重复两次，结果相似。

图3. 立体定向放射治疗联合抗PD-1免疫疗法显著提高肿瘤控制并增强抗原特异性T细胞和B细胞介导的抗肿瘤免疫反应。

本研究探讨了立体定向放射治疗(Stereotactic XRT)与抗PD-1免疫疗法联合应用对肿瘤控制和抗原特异性T细胞及B细胞介导的抗肿瘤免疫反应的影响。A部分研究了接种3×10^5 B16-OVA肿瘤细胞的小鼠(每组n=8)，在第12天接受12 Gy的单次放射治疗和/或在放射治疗前1天开始接受200毫克抗PD-1抗体的腹腔注射，之后每3天一次，共三次注射;实验重复三次，结果相似。B部分分析了在第10天从野生型(非肿瘤携带)或B16-OVA肿瘤携带小鼠中分离出的CD8+ SIINFEKL Pentamer+ T细胞的百分比，这些小鼠接受了指定的治疗;代表了三个独立实验的结果。C部分的散点图显示了接受XRT加抗PD-1抗体治疗的小鼠中SIINFEKL Pentamer+ T细胞显著增加(P < 0.05;P < 0.01)。D部分测量了在第18天接受12×10^6静脉转移脾细胞的野生型小鼠的肿瘤体积，这些脾细胞来自接受了指定治疗的小鼠(在第14天采集)，随后在第15天接受2×10^5 B16-OVA细胞的肿瘤挑战。E部分通过OVA抗体ELISA测量了接受指定治疗的小鼠(每组n=8-11只，放射治疗后第14天采集)血清中抗OVA IgG1的浓度。

图4. 单剂量立体定向放射治疗(XRT)诱导肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)并与抗PD-1检查点阻断协同作用。

本研究评估了单剂量立体定向放射治疗(XRT)对肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)的影响以及其与抗PD-1检查点阻断的协同效应。A部分展示了从接受指定治疗的肿瘤携带小鼠中在第14天分离出的TILs的点图，分别显示了CD4与CD8(上部)以及SIINFEKL Pentamer+与CD8(下部)的分布，这些结果代表了三个独立实验的典型结果。B和C部分，对接受XRT和抗PD-1抗体治疗的小鼠中CD8和CD4 TILs的绝对数量显著增加进行了量化分析。D部分描述了在治疗组中TILs中CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T细胞(Tregs)的百分比变化。E部分显示了在接受XRT加抗PD-1抗体治疗的小鼠的TILs中，CD8+ Pentamer+效应T细胞与CD4+ CD25+ Foxp3+ Tregs的比率显著增加(P < 0.01;P < 0.05;ns，无统计学意义)。这些结果表明，单剂量XRT能够诱导TILs，并与抗PD-1检查点阻断治疗产生协同效应，增强抗肿瘤免疫反应。

图5. 立体定向放射治疗联合抗PD-1免疫疗法显著改善4T1-HA肿瘤控制并增强抗原特异性T细胞的发展。

本研究探讨了立体定向放射治疗(Stereotactic XRT)与抗PD-1免疫疗法联合应用对4T1-HA肿瘤控制的影响及其对抗原特异性T细胞发展的促进作用。A部分观察了接种1×10^6 4T1-HA细胞的小鼠在第9天接受放射治疗(12 Gy一次)和/或从放射治疗前1天开始接受200毫克抗PD-1抗体的腹腔注射，之后每3天一次，共三次注射的肿瘤体积变化;代表了两个独立实验的结果。B部分分析了在第14天从野生型或4T1-HA肿瘤携带小鼠的引流淋巴结(DLNs)中分离出的CD8+ HA Pentamer+ (H2-Kd IYSTVASSL)细胞的百分比;代表了两个独立实验的结果。C部分量化了接受XRT和抗PD-1免疫疗法的小鼠中CD8+ Pentamer+细胞数量的增加。D部分描述了在接受指定治疗的4T1-HA肿瘤携带小鼠的肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)中CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T细胞(Tregs)的变化。E部分显示了在DLNs中CD4+ CD25+ Foxp3+ Tregs没有显著变化;代表了两个独立实验的结果。

图6.单剂量立体定向放射治疗(XRT)减少淋巴结中抗原特异性T细胞的初始比例并增加效应记忆T细胞。

本研究探讨了单剂量立体定向放射治疗(XRT)对肿瘤特异性T细胞的影响，特别是在淋巴结中的分布变化。A部分展示了从野生型或B16-OVA肿瘤携带小鼠的淋巴结中分离出的CD4- CD8+ SIINFEKL Pentamer+内源性T细胞的流式细胞图，这些小鼠在第14天接受了指定的治疗，结果代表了三个独立实验。B部分的饼图显示了治疗组中记忆细胞群体的相对百分比。C部分量化了野生型或B16-OVA治疗组淋巴结中初始、中心记忆和效应记忆T细胞的绝对数量。D至F部分分别展示了从4T1-HA肿瘤携带小鼠中分离出的CD4- CD8+ IYSTVASSL Pentamer+ T细胞的记忆图表，代表了两个独立实验的结果。这些数据表明，XRT能够减少淋巴结中初始抗原特异性T细胞的比例，并增加抗原特异性效应记忆T细胞的数量。

研究结论

放射治疗(XRT)通过多种机制增强了肿瘤抗原的呈递和特异性T细胞反应，从而提升了抗肿瘤免疫效果。具体来说，XRT处理显著增加了B16黑色素瘤和MC38结直肠癌细胞系对模型抗原(OVA或HA)的呈递。体外实验中，XRT增强了肿瘤细胞的直接抗原呈递能力，使得B3Z杂交瘤细胞能更有效识别这些细胞。在体内环境中，XRT通过交叉呈递进一步增强了肿瘤抗原的T细胞识别，导致B16-OVA肿瘤处理后引流淋巴结中抗原特异性T细胞显著增殖。此外，无论是单独使用XRT还是与抗PD-1治疗结合，都能增强抗原特异性CD8 T细胞和B细胞的启动，尤其在肿瘤引流淋巴结和脾脏中OVA特异性T细胞的数量显著增加。XRT与PD-1阻断的联合治疗还增加了已建立的B16和4T1肿瘤中内源性T细胞的浸润，以及肿瘤特异性CD8 T细胞记忆表型的产生。这些结果共同表明，XRT与免疫治疗(如PD-1阻断)的结合可以有效地增强抗原特异性免疫反应，包括增加抗原呈递、T细胞浸润和记忆T细胞的产生，从而为肿瘤治疗提供了一种新的策略。