基于明亮生物发光的BRET传感器蛋白用于检测细胞内半胱天冬酶活性

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。

NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Bright Bioluminescent BRET Sensor Proteins for Measuring Intracellular Caspase Activity

中文标题：基于明亮生物发光的BRET传感器蛋白用于检测细胞内半胱天冬酶活性

发表期刊：《ACS Sensors》

影响因子：8.9

作者单位(前三位)：

1. Laboratory of Chemical Biology and Institute for Complex Molecular Systems, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, Den Dolech 2, 5612 AZ Eindhoven, The Netherlands

2. Hubrecht Institute-KNAW and University Medical Center Utrecht, 3584 CT Utrecht, The Netherlands

3. Division of Heart and Lungs, Department of Cardiology, University Medical Center Utrecht, 3584 CX Utrecht, The Netherlands

作者信息(前三位)：

Anniek den Hamer, Pieterjan Dierickx, Remco Arts

研究背景

半胱天冬酶(Caspase)是调控细胞凋亡的关键蛋白酶，其活性检测对研究疾病机制(如癌症、神经退行性疾病)至关重要。传统基于荧光共振能量转移(FRET)的传感器依赖外部激发光，存在光毒性、自发荧光干扰及散射问题，限制了在光敏感细胞、高通量检测和活体成像中的应用。本研究开发了基于生物发光共振能量转移(BRET)的新型传感器，利用高亮度、稳定的NanoLuc荧光素酶与mNeonGreen荧光蛋白，通过含半胱天冬酶识别位点的柔性连接子构建传感器。BRET无需外部激发光，克服了FRET的局限性，适用于复杂生物环境中的实时检测。

研究方法

1. 传感器设计：将NanoLuc(NLuc)与mNeonGreen(mNG)通过含半胱天冬酶-3/8/9特异性识别序列的17氨基酸连接子融合，构建C3-BRET、C8-BRET和C9-BRET三种传感器。

2. 体外验证：在大肠杆菌中表达并纯化传感器蛋白，通过发光光谱分析BRET效率变化，验证连接子被靶向半胱天冬酶切割后的信号响应(10倍比率变化)。

3. 细胞实验：在HeLa细胞中瞬时转染传感器，使用凋亡诱导剂STS(Staurosporine)激活半胱天冬酶，通过酶标仪和单细胞成像检测BRET信号动态变化。

4. 对比分析：与FRET传感器SCAT3比较，验证BRET在细胞群体检测中的抗干扰优势，并通过突变关键氨基酸(D→A)验证特异性。

实验结果

图1：BRET传感器结构设计与体外切割响应验证

本图展示了BRET传感器的分子结构及体外半胱天冬酶切割验证。传感器由NanoLuc荧光素酶(NLuc，蓝色)与mNeonGreen荧光蛋白(mNG，绿色)通过含半胱天冬酶识别序列(如DEVDG用于Caspase-3)的17氨基酸柔性连接子(红色)连接。未切割时，NLuc催化底物furimazine产生460nm生物发光，通过高效BRET激发mNG发射517nm荧光，BRET比率(mNG/NLuc)高达2.0。加入重组Caspase-3后，连接子被切割，mNG脱离导致其荧光信号消失，BRET比率降至0.2(10倍变化)。体外发光光谱及SDS-PAGE验证了切割特异性和效率，证明传感器对靶标酶的高响应性。

图2：半胱天冬酶亚型特异性与交叉活性分析

通过对比C3-BRET(靶向Caspase-3)、C8-BRET(Caspase-8)和C9-BRET(Caspase-9)的体外响应，评估传感器亚型特异性。实验显示，C3-BRET对Caspase-3的敏感性最高(EC50=0.5 nM)，但对高浓度Caspase-8/9(>10 nM)存在交叉活性(BRET比率下降30%)。通过定点突变(将识别序列中的关键天冬氨酸D突变为丙氨酸A)，证实交叉活性源于序列相似性。此外，使用泛Caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理可完全阻断信号响应，验证了传感器对酶活性的依赖。结果表明，C3-BRET适用于Caspase-3主导的凋亡通路研究，但需谨慎解读复杂样本中多酶共存的干扰。

图3：细胞水平BRET信号检测与FRET性能对比

在HeLa细胞中瞬时表达C3-BRET或FRET传感器SCAT3，通过凋亡诱导剂STS(1 μM，6小时)激活Caspase-3。酶标仪检测显示，BRET传感器在未处理细胞中背景信号极低(信噪比>50)，STS处理后BRET比率下降90%，而FRET传感器因激发光散射和细胞自发荧光导致信号无法区分(变化<10%)。通过动力学曲线分析，BRET信号在凋亡启动后2小时内达到平台期，与Western blot检测的Caspase-3切割时间一致。该实验凸显BRET在群体细胞检测中无需外部激发光的核心优势，尤其适用于高通量药物筛选或光敏感类器官模型。

图4：单细胞动态成像揭示凋亡进程异质性

采用共聚焦显微镜对表达C3-BRET的HeLa细胞进行单细胞动态成像(每5分钟采集一次)。STS处理后，BRET比率(伪彩色：绿→蓝)在单个细胞中呈现异步下降，部分细胞在凋亡启动后2-3分钟内完成信号转换，而邻近细胞延迟≥1小时，表明凋亡信号传递的异质性。通过定量分析，80%的细胞在STS处理4小时内激活Caspase-3，且BRET信号变化与FRET传感器SCAT3结果一致(R²=0.92)。图像还显示，凋亡细胞形态皱缩前BRET信号已显著下降，提示Caspase激活早于形态学变化。该数据为研究凋亡动力学及细胞间通讯提供了高时空分辨率工具。

研究结论

1. 高灵敏与稳定性：BRET传感器在体外和细胞内均表现出10倍的比率变化，检测限低至12.5 pM(Caspase-3)，且信号稳定，适合长时间成像。

2. 克服FRET局限：无需外部激发光，显著降低背景干扰，成功应用于高通量酶标仪检测，而FRET传感器因自发荧光无法区分信号。

3. 单细胞动态监测：通过BRET成像实时捕捉HeLa细胞凋亡过程中半胱天冬酶激活的异质性，显示激活后2-3分钟内完成传感器切割，与FRET结果一致。

4. 应用潜力：该传感器家族为药物筛选、光敏感细胞研究及活体成像提供了新工具，未来可通过替换识别序列扩展至其他蛋白酶检测。