非洲猪瘟病毒双报告基因重组体构建与高通量药物筛选

基本信息

英文标题：Construction of a recombinant African swine fever virus with firefly luciferase and eGFP reporter genes and its application in high-throughput antiviral drug screening

中文标题：非洲猪瘟病毒双报告基因重组体构建与高通量药物筛选

发表期刊：《Antiviral Research》

影响因子：6.3

作者单位：

1.National Key Laboratory of Agricultural Microbiology, College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China.

2.Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine in Hubei Province, The Cooperative Innovation Center for Sustainable Pig Production, Wuhan 430070, China.

3.Hubei Hongshan Laboratory, Wuhan 430070, China.

作者信息：Xinglin He, Pengfei Li, Hua Cao

研究背景

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的高度致死性传染病，对全球养猪业造成毁灭性影响。目前尚无安全有效的疫苗或药物。ASFV基因组复杂，感染机制不明确，且传统基于原代细胞的病毒研究存在重复性低、成本高等问题。本研究旨在通过CRISPR/Cas9技术构建携带双报告基因(萤火虫荧光素酶Fluc和增强绿色荧光蛋白eGFP)的重组ASFV，并利用其建立高通量药物筛选平台，以加速抗病毒药物开发。

研究方法

1.病毒适应：将ASFV-0428C株在Vero细胞中连续传代，获得适应株(ASFV-CA)。

2.重组病毒构建：通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在ASFV基因组MGF505-1R位点插入Fluc和eGFP表达盒，构建重组病毒rASFV-Fluc-eGFP。

3.功能验证：通过荧光显微镜观察eGFP表达、荧光素酶活性检测(Fluc)及PCR测序验证重组病毒稳定性。

4.高通量筛选：基于Vero细胞模型，筛选FDA批准化合物库中的218种化合物，通过细胞毒性(CCK-8法)和病毒抑制率评估候选药物。

5.候选药物验证：在Vero和猪肺泡巨噬细胞(PAM)中验证候选药物对野生型ASFV的抑制效果。

实验结果

图1：ASFV在Vero细胞中的适应与复制

展示ASFV适应株(ASFV-CA)在Vero细胞中的细胞病变效应(CPE)、免疫荧光染色(p72蛋白表达)及增殖曲线，证明其高效复制能力。

图2：重组病毒rASFV-Fluc-eGFP的构建

通过CRISPR/Cas9技术插入双报告基因，荧光显微镜显示eGFP表达，Western blot验证病毒结构蛋白p72，证实重组病毒成功构建。

图3：重组病毒的遗传稳定性

连续传代后检测eGFP荧光强度、Fluc活性及PCR验证，证明报告基因稳定整合且不影响病毒增殖。

图4：感染模型优化

确定最佳感染条件(MOI=0.2，孵育时间24-30小时)，荧光素酶活性与病毒剂量呈正相关，为高通量筛选提供标准化参数。

图5：药物筛选与验证

筛选出SAC为首选候选药物，在Vero和PAM细胞中均显著抑制ASFV(TCID50降低2-3个对数级)，并通过时间添加实验推测其作用阶段为病毒吸附期。

研究结论

成功构建了稳定表达Fluc和eGFP的重组ASFV(rASFV-Fluc-eGFP)，该病毒在Vero和PAM细胞中均能高效复制，且报告基因表达与病毒滴度正相关。基于此模型筛选出5种候选化合物，其中丹参酚酸C(SAC)在两种细胞中均表现出显著抗病毒活性(抑制率>90%)和低毒性。SAC通过干扰病毒吸附或入侵阶段抑制ASFV增殖，为ASF防控提供了潜在药物靶点。