乳腺癌及其脑转移的MMP-2触发线粒体靶向PROTAC-PDT治疗

基本信息

英文标题：MMP-2-triggered, mitochondria-targeted PROTAC-PDT therapy of breast cancer and brain metastases inhibition.

中文标题：乳腺癌及其脑转移的MMP-2触发线粒体靶向PROTAC-PDT治疗

发表期刊：《Nature Communications》

影响因子：17.69

作者单位：四川大学华西医院、海南大学药学院

作者信息：Fan Tong, Yufan Wang, Yanyan Xu, Yang Zhou, Siqin He, Yufan Du, Wenqin Yang, Ting Lei, YujunSong, Tao Gong, Huile Gao.

研究背景

PROTAC技术是一种蛋白质阻断技术，具有抗肿瘤效果。

PROTAC技术的应用受到肿瘤内分布和积累不足的限制。

设计了一种新的纳米药物dBET6@CFMPD，它结合了PROTAC和光动力疗法(PDT)。

dBET6@CFMPD具有良好的生物分布性和保留性。

dBET6@CFMPD能够有效抑制原发性和转移性肿瘤的生长。

dBET6@CFMPD是一种有潜力的癌症联合治疗纳米药物。

研究方法

研究设计：所有动物实验均遵循川大伦理委员会指南，并经伦理委员会批准。细胞系包括小鼠4T1乳腺癌细胞、E0771乳腺癌细胞和RAW264.7细胞，均经过STR分析验证。实验过程中，肿瘤大小不超过1500 mm3。

材料准备：实验所用材料包括氯素e6、MMP-2响应肽、BRD4抑制剂dBET6、DSPE-PEG2000-Mal、DSPE-PEG3400-NH2等，均购自国内外试剂公司。

Ce6-PEGylated MMP-2响应肽的合成：通过 maleimide 反应将肽的末端 sulfhydryl 与 DSPE-PEG2000-Mal 相连，再与活化的 Ce6 形成偶联物。

纳米粒子的制备和表征：采用文献报道的方法，将CFMPD、dBET6溶于DMF中，混合后加入水中，通过离心过滤得到纳米粒子。利用DLS和TEM对纳米粒子进行表征。

MMP-2响应性测试：将CFMPD和CFPD与MMP-2酶孵育，通过MALDI-TOF-MS监测分子量变化。同时，利用DLS和TEM观察纳米粒子尺寸和形态变化。

细胞摄取实验：4T1细胞与不同制剂孵育，通过流式细胞仪和荧光显微镜检测细胞内Ce6的摄取。

体内分布和保留实验：将小鼠接种4T1细胞建立乳腺癌模型，通过IVIS成像系统监测不同制剂的体内分布和肿瘤保留效果。

BBB穿透和脑积聚实验：利用bEnd.3细胞建立BBB模型，检测不同制剂的BBB穿透效率和脑积聚效果。

体内抗肿瘤和抗转移实验：对小鼠进行乳腺癌细胞皮下注射，建立原发肿瘤和肺转移模型，通过不同制剂治疗，评估其体内抗肿瘤和抗转移效果。

免疫反应评估：收集肿瘤、DLN和脾脏细胞，通过流式细胞仪和ELISA检测免疫细胞和细胞因子水平，评估免疫反应。

统计分析：所有数据以平均值±标准差表示，采用GraphPad Prism软件进行统计分析，通过学生t检验和方差分析进行两组或多组间的统计学比较。

实验结果

图1. 纳米药物的制备与表征。

要点：

a. 图示说明：

dBET6@CFMPD 的组成及其对原发性乳腺癌和脑转移的治疗效果。

插图由 BioRender.com 制作，并根据知识共享署名-非商业性-禁止演绎 4.0 国际许可发布。

b. 纳米药物表征：

dBET6@CPD 的动态光散射(DLS)结果和透射电镜(TEM)图像。

dBET6@CFPD 的TEM图像。

dBET6@CFMPD 的TEM图像(标尺 = 200 纳米)。

c. 分子质量变化：

CFPD 和 CFMPD 在与MMP-2孵育4小时和24小时后的分子质量变化，通过基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析检测。

补充图 10 和 11 中包含了 e, f 的 MALDI-TOF-MS 谱图。

d. MMP-2 孵育后的TEM图像：

dBET6@CFMPD 与MMP-2孵育后的TEM图像(标尺 = 2 微米)。

e. 细胞处理后的TEM图像：

经CFPD处理的细胞的TEM图像(标尺 = 500 纳米)。

经CFMPD处理的细胞的TEM图像和放大图像。

红色箭头和蓝色箭头分别指示球状纳米颗粒和纳米纤维。

f. 数据提供：

源数据以源数据文件的形式提供。

图2. 细胞摄取、保留和线粒体靶向。

要点：

a, b 细胞摄取测定：

使用荧光显微镜对不同制剂的细胞摄取进行测定(标尺 = 100 微米)。

c, d 细胞摄取测定：

使用流式细胞仪对不同制剂的细胞摄取进行测定(n = 3 个独立细胞系)。

e 共聚焦图像：

4T1 间充质干细胞与游离Ce6、CPD、CFPD和CFMPD孵育12小时后的共聚焦图像(标尺 = 100 微米)。

f 肿瘤球体切片定量分析：

对100微米厚的肿瘤球体切片进行定量分析。

g 线粒体定位分析：

对4T1细胞中不同制剂的线粒体定位进行分析(标尺 = 20 微米)。

h TEM图像：

经CFMPD处理的细胞的透射电镜图像(标尺 = 1 微米)，红色箭头指示线粒体嵴。

数据表示：

所有数据均以平均值 ± 标准差(SD)的形式呈现。

统计学比较：

两组之间的比较采用双尾Student's t检验;多组之间的比较采用单因素方差(ANOVA)及Tukey后续检验。

显著性判定：

当p值 < 0.05时，认为差异具有统计学意义。

数据提供：

源数据以源数据文件的形式提供。

图3. BRD4抑制和体外抗肿瘤效果。

a. 通过Western blot分析4T1细胞中BRD4的抑制情况以及EMT下调情况。G1-G6分别代表对照组、dBET6&Ce6+L组、CFMPD+L组、dBET6@CPD+L组、dBET6@CFPD+L组和dBET6@CFMPD+L组。

b. 检测不同制剂处理4T1细胞后的PD-L1表达水平。

c. 通过流式细胞仪检测不同制剂处理后4T1细胞内ROS的生成情况(n=3个独立实验细胞系)。

d. 与父本纳米粒子孵育的4T1细胞进行MTT细胞活力实验。

e. 与BET6负载纳米粒子孵育的4T1细胞进行MTT细胞活力实验(n=3个独立细胞系)。

f. 检测不同制剂处理后4T1细胞的凋亡情况。

g. 统计凋亡分析的结果(n=3个独立细胞系)。

h. 对不同制剂孵育的4T1细胞进行活/死双重染色(标尺=100μm)。

所有数据以平均值±标准差表示。两组间的比较采用双尾Student's t检验，多组间的比较采用单因素方差分析(ANOVA)及Tukey事后检验。p值<0.05视为有统计学意义的差异。

源数据以Source Data文件形式提供。

图4. ICD评估、巨噬细胞极化及抗转移效果。

a, b. 通过共聚焦显微镜和流式细胞仪检测4T1细胞表面的CRT暴露情况(标尺=50μm，n=3个独立细胞系)。

c, d. 检测不同制剂孵育后肿瘤细胞外分泌的HMGB-1和ATP水平(n=3个独立细胞系)。

e–g. 检测不同制剂处理后RAW264.7细胞分泌的IL-10、TGF-β和IFN-γ水平(n=3个独立细胞系)。

h, i. 通过流式细胞仪分析不同制剂孵育后RAW264.7细胞中CD86+和CD206+细胞的丰富度(n=3个独立细胞系)。

j–l. 显微镜下观察不同制剂处理后4T1细胞的伤口愈合实验、迁移实验和侵袭分析(标尺=100μm)。

所有数据以平均值±标准差表示。两组间的比较采用双尾Student's t检验，多组间的比较采用单因素方差分析(ANOVA)及Tukey事后检验。p值<0.05视为有统计学意义的差异。

源数据以Source Data文件形式提供。

图5. 纳米药物体内靶向效率和保留效果评估。

a. 静脉注射后1、2、4、8、12、24小时对小鼠进行体内成像。

b. 肿瘤的体外成像。

c. 静脉注射后24小时对主要器官和肿瘤进行半定量分析(n=4只小鼠)。

d. 肿瘤内注射后5分钟、4、8、12、24、36和48小时对小鼠进行体内荧光成像。

e. 肿瘤的体外成像(48小时)。

f. 肿瘤的半定量分析(n=4只小鼠)。

g. 肿瘤冷冻切片的荧光分布情况(标尺=100μm)。

所有数据以平均值±标准差表示。两组间的比较采用双尾Student's t检验，多组间的比较采用单因素方差分析(ANOVA)及Tukey事后检验。p值<0.05视为有统计学意义的差异。

源数据以Source Data文件形式提供。

图6. 脑靶向能力评估。

a. 血脑屏障(BBB)体外构建过程示意图以及BBB穿越过程。图1a使用BioRender.com创建，并根据知识共享署名-非商业性-禁止演绎4.0国际许可发布。

b. 经过4小时纳米粒子(NPs)引入后，下室液体中的荧光强度(n=3个独立实验单元)。

c. 下室中4T1细胞摄取的纳米粒子的荧光强度(n=3个独立系)。

d. 静脉注射后1、2、4、8小时，带有脑转移肿瘤的小鼠的体内成像。

e, f. 静脉注射后8小时，主要器官和大脑的体外成像。

g, h. 主要器官和大脑的半定量分析(n=4只小鼠)。

所有数据以平均值±标准差表示。两组间的比较采用双尾Student's t检验，多组间的比较采用单因素方差分析(ANOVA)及Tukey事后检验。p值<0.05视为有统计学意义的差异。

源数据以Source Data文件形式提供。

图7. 体内抗肿瘤和抗转移效果评估。

a. 每2天记录一次4T1肿瘤小鼠的肿瘤体积(n=6只小鼠)。

b. 4T1乳腺癌模型的肿瘤重量(n=6只小鼠)。

c. 接受不同制剂治疗的 mice 的体重(n=6只小鼠)。

d. 肿瘤切片的Ki67和TUNEL染色实验(标尺=2毫米)。

e, f. 肺转移的体外成像和统计结果(n=5只小鼠)。

g. 肺组织的HE染色图像(HE图像中的标尺=5毫米，放大图像中的标尺=100微米)。

h, i. 复发肿瘤的重量和体外成像(n=5只小鼠)。

G1–G8分别代表对照组、dBET6组、Ce6+L组、CFMPD+L组、dBET6@CFMPD组、dBET6@CPD+L组、dBET6@CFPD+L组和dBET6@CFMPD+L组。

所有数据以平均值±标准差表示。两组间的比较采用双尾Student's t检验，多组间的比较采用单因素方差分析(ANOVA)及Tukey事后检验。p值<0.05视为有统计学意义的差异。

源数据以Source Data文件形式提供。

图8. 原发肿瘤和脑转移瘤的抑制效果。

a. 携带脑转移瘤的小鼠的生物发光成像。

b. 肿瘤接种后第8、16和24天的生物发光成像半定量结果(n=10只小鼠)。

c. 原发肿瘤的体积(n=10只小鼠)。

d, e. 原发肿瘤的体外成像和重量(n=10只小鼠)。G1–G4分别代表对照组、CFMPD+L组、BET6@CFPD+L组和BET6@CFMPD+L组。

f. 携带脑转移瘤和原发肿瘤的小鼠的生存率分析(n=10只小鼠)。生存研究通过双尾对数秩和检验(Mantel-Cox)进行分析。

g. 脑组织的HE染色图像(标尺=2毫米)。

所有数据以平均值±标准差表示。两组间的比较采用双尾Student's t检验，多组间的比较采用单因素方差分析(ANOVA)及Tukey事后检验。p值<0.05视为有统计学意义的差异。

源数据以Source Data文件形式提供。

图9. 体内抗肿瘤免疫反应评估。

a. 代表性的免疫荧光图像，用于检测肿瘤切片中的CRT和HMGB1水平(标尺=50μm)。

b–d. LNs中CD80+ CD86+ DCs、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的百分比。脾脏中CD8+ T细胞(e)、中心记忆T细胞(Tcm，CD44+CD62L+)(f)和效应记忆T细胞(Tem，CD44+CD62L-)(g)的量化数据。

h. 肿瘤中IFN-γ+ CD8+ T细胞的丰富度(h)、CD4+ T细胞(i)和调节性T细胞(Treg细胞)(j)。

k. 不同治疗后肿瘤中PD-L1+细胞的百分比。

l, m. 肿瘤中M1(l)和M2(m)细胞的流式细胞仪分析。

n, o. 原发肿瘤和脑转移肿瘤小鼠的DLNs中CD8+ T细胞(n)和CD4+ T细胞(o)的流式细胞仪测量。

p, q. 不同治疗后大脑中M1(p)和M2(q)细胞的百分比。

r. 代表性的免疫荧光图像，观察不同处理后大脑中的CD86+和CD206+细胞(标尺=1mm)。绿色和红色荧光信号分别表示CD86和CD206。

所有实验每组n=4只小鼠。所有数据以平均值±标准差表示。两组间的比较采用双尾Student's t检验，多组间的比较采用单因素方差分析(ANOVA)及Tukey事后检验。p值<0.05视为有统计学意义的差异。

源数据以Source Data文件形式提供。

图10. E0771携带小鼠的抗转移效果和抗肿瘤免疫反应。

a. 携带脑转移瘤的小鼠的生物发光成像。

b. 肿瘤接种后第8、16和24天的生物发光成像半定量结果。

c, d. 原发肿瘤的体外成像和重量。

e–g. LNs中CD80+ CD86+ DCs、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的百分比。

h–k. 脾脏中CD80+ CD86+ DCs、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和中心记忆T细胞(Tcm细胞)的丰富度。

l–o. 肿瘤中CD8+ T细胞、PD-L1+细胞、调节性T细胞(Treg细胞)和M1细胞的丰富度。

对于原发肿瘤生长和生物发光成像研究(a, b, d)，每组n=9只小鼠。对于其他研究，每组n=5只小鼠。

所有数据以平均值±标准差表示。两组间的比较采用双尾Student's t检验，多组间的比较采用单因素方差分析(ANOVA)及Tukey事后检验。p值<0.05视为有统计学意义的差异。

源数据以Source Data文件形式提供。

研究结论

我们构建了一种多功能纳米药物dBET6@CFMPD，它基于MMP-2响应肽序列自我组装成球形纳米颗粒，具有可变形状和线粒体靶向能力，用于改善PROTAC的肿瘤特异性积聚并联合PDT。

dBET6@CFMPD在肿瘤中积聚后，响应MMP-2转化为纳米纤维，增强Ce6的保留以改善PDT效率，并诱导强烈的ICD。

dBET6抑制肿瘤细胞的c-Myc和PD-L1表达，通过PROTAC诱导细胞凋亡。同时，dBET6可以极化TAMs至M1表型，与ICD和PD-L1下调协同作用，重塑TIME并触发强烈的抗肿瘤免疫应答。

多功能纳米药物dBET6@CFMPD通过整合PROTAC和PDT-免疫疗法，可以重塑TIME并诱导强烈的抗肿瘤免疫应答，从而抑制原发和转移肿瘤的发展，为癌症联合治疗提供了一种策略。