利用人源iPSC来源肝细胞培养基优化NTCP重构HepG2细胞HBV感染

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：Elevated NTCP expression by an iPSC-derived human hepatocyte maintenance medium enhances HBV infection in NTCP-reconstructed HepG2 cells.

中文标题：通过人源iPSC来源的肝细胞维持培养基提高NTCP重构的HepG2细胞中HBV感染。

发表期刊：《Cell & Bioscience》

影响因子：6.1

作者单位：

Center for Vaccines and Immunity, The Abigail Wexner Research Institute

at Nationwide Children’s Hospital, Columbus, OH 43205, USA.

作者信息：

Xinlei Li, Zhaohui Xu, Bidisha Mitra, Minghang Wang, Haitao Guo, Zongdi Feng.

研究背景

NTCP是HBV的关键受体，重构的HepG2-NTCP肝癌细胞支持HBV感染但效率不高，未观察到病毒扩散。全球约有2.57亿慢性HBV感染者，但现有抗病毒药物无法根除病毒。HBV是一种有包膜的病毒，含有约3200个核苷酸的松弛环状DNA基因组。由于缺乏有效的细胞培养系统和动物模型，新药物和治疗方法的发展受限。NTCP表达在增殖或再生的肝细胞中难以维持高水平。

研究方法

HepG2-NTCP细胞在含有10% FBS、1%青霉素和链霉素以及8 μg/ml blasticidin的DMEM培养基中培养，而HBV颗粒则从HepDE19细胞培养上清中收集。在试剂方面，HepG2和HepG2-NTCP细胞使用TaKaRa Bio USA提供的Hepatocyte maintenance medium (HMM)进行预处理或长期培养，NTCP抗体则由瑞士苏黎世大学化学和应用生物科学系的Bruno Stieger博士提供。在HBV感染实验中，HepG2或HepG2-NTCP细胞在接种HBV前24小时用HMM预处理，感染后更换为HMM或D10/2%DMSO培养基。免疫荧光染色方面，不同时间点感染的细胞用4%多聚甲醛固定后，经过封闭、渗透、特异性一抗和二抗染色、DAPI复染，并在显微镜下观察。RNA-Seq分析中，HepG2-NTCP细胞用D10/2%DMSO或HMM预处理24小时后提取总RNA，去除rRNA后获得mRNA片段和cDNA，建库并在Illumina HiSeq 4000平台上产生6000万对端读长150 bp的测序数据。最后，使用DAVID程序对差异表达基因进行基因本体(GO)分析，并利用KEGG数据库理解高级生物功能和通路。

实验结果

图1. 肝细胞维持培养基(HMM)增强了HepG2-NTCP细胞中的乙型肝炎病毒(HBV)感染。

首先，HepG2-NTCP细胞用100或500基因组当量(GE)/细胞的HBV在含有4%聚乙二醇8000(PEG8000)的DMEM或HMM中稀释，并在有无10 μM环孢素A(CsA)的情况下接种。16小时后，移除接种液，细胞被洗涤并重新用含有10% FBS和2% DMSO的DMEM(D10/2% DMSO)或HMM培养。接种后10天，细胞被固定，并使用抗HBc抗体进行免疫荧光染色。细胞核用DAPI染色。其次，HMM在HBV接种前、中或后被加入到HepG2-NTCP细胞培养中(100 GE/细胞)。接种后10天(B)或8天(C)，细胞被固定并用抗HBc抗体染色。比例尺=50 μm。使用NIH的ImageJ软件对HBV感染区域进行量化，并将数据标准化为在常规培养基(D10/2% DMSO)中用100 GE/细胞的HBV感染的培养值，并以两个独立实验的平均值±标准误差呈现。

图2. 肝细胞维持培养基(HMM)处理诱导异位NTCP表达。

A. 在D10/2%DMSO培养基或HMM中培养24或72小时后，通过实时定量PCR(RT-qPCR)检测HepG2和HepG2-NTCP细胞中NTCP mRNA水平。未处理的D10培养基不含2% DMSO。

B. 在指定培养基中培养24、48或72小时后，HepG2-NTCP或亲本HepG2细胞中NTCP蛋白表达的免疫荧光图像。原代肝细胞维持培养基(PMM)含有10% FBS、1%青霉素/链霉素、0.17 μM人类胰岛素、10 μM氢化可的松21-半琥珀酸盐和1.8% DMSO。

C. HepG2-NTCP细胞在接种HBV(500 GE/细胞)前未感染或用HMM或PMM预处理16小时，然后在含有4% PEG 8000的PMM中接种HBV 24小时。移除HBV接种液后，细胞在PMM中维持7天。

D. 在HBV感染后10天，不同HepG2-NTCP克隆中NTCP、HBc(红色)和HBs(绿色)的表达。本研究中大多数实验使用了克隆12。

E. HepG2-NTCP细胞转染含有CMV-IE启动子或EF1α启动子控制的GFP编码质粒后，在指定培养基中培养指定时间的GFP表达。比例尺=50 μm。

图3. 经过HMM处理的HepG2-NTCP细胞的转录组分析显示，HMM或D10/2%DMSO培养基(对照组)处理24小时后，共鉴定出2727个差异表达基因(DEGs)，包括1310个上调和1417个下调的DEGs。

与对照组相比，HMM处理组中NTCP的表达增加了6.4倍。KEGG通路分析显示，HMM激活的前三条通路包括代谢途径、神经活性配体-受体相互作用以及细胞因子-细胞因子受体相互作用。HMM还增强了HepG2-NTCP细胞中的代谢活动，这通过与成熟肝细胞功能相关的KEGG通路得到证实，包括脂质代谢、氨基酸合成和外源物质代谢。相比之下，下调的DEGs最丰富的通路包括酒精中毒、癌症途径和系统性红斑狼疮。在162个与HBV相关的基因(KEGG通路hsa05161)中，上调的基因包括SOS1、SLC10A1(NTCP)、STAT4和FASLG;而下调的基因有17个，其中TNF、MAP2K6、E2F1和CCNE2下调最为显著。值得注意的是，TNF能够通过破坏病毒衣壳的完整性来抑制HBV复制，而E2F1或CCNE2的下调可能导致细胞周期停滞，这可能有利于HBV复制。然而，由于HMM对HBcAg和HBsAg表达的最大效应是在HBV接种前添加HMM实现的，通过NTCP上调增加HBV进入似乎是HMM增强HBV感染的主要机制。

图4. HMM与PEG的组合并未导致HepG2-NTCP细胞中HBV的传播。

在HBV感染前，HepG2-NTCP细胞先用HMM或D10/2%DMSO预处理24小时。接种液移除后，细胞随后在HMM或D10/2%DMSO培养基中单独培养或补充4% PEG8000，培养5或10天。通过使用HBc抗体的免疫荧光测定HBV感染率。比例尺=50 μm。

研究结论

商业肝细胞维持培养基(HMM)在接种乙型肝炎病毒(HBV)前24小时的短期处理能显著提高HBV对NTCP重构的HepG2细胞的感染效率，这一效果是通过增强CMV启动子驱动的NTCP表达实现的。不同克隆的HepG2-NTCP细胞以及不同批次的HMM均显示出一致的效果，表明该方法也适用于其他使用CMV启动子驱动NTCP重构的细胞培养系统。HMM能快速诱导HepG2-NTCP细胞中NTCP的表达，但长期培养并不会导致NTCP表达的进一步增加。尽管HMM激活了多种代谢途径，但其如何增强CMV IE启动子活性的具体机制尚不清楚，需要进一步研究以确定HMM中提高NTCP表达和HBV感染的活性成分。这项研究提供了一个简单有效的方法，显著改善了NTCP重构的HepG2细胞中HBV的感染，为HBV的基础和抗病毒研究开辟了新途径。