通过D-荧光素的外排动力学筛选传统中药中的多药耐药逆转剂

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Screening Multidrug Resistance Reversal Agents in Traditional Chinese Medicines by Efflux Kinetics of DLuciferin in MCF-7/DOXFluc Cells

中文标题：通过D-荧光素的外排动力学筛选传统中药中的多药耐药逆转剂

发表期刊：《ACS Omega》

影响因子：3.4

作者单位：

1.College of Pharmaceutical Sciences and Academy of Chinese Medical Science, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou, Zhejiang 311258, China

2.College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou, Zhejiang 311258, China

作者信息：Yue Zhao,Chaoyuan Tang,Jingyi Huang

研究背景

乳腺癌是全球女性癌症患者的主要死亡原因，而药物耐药性是化疗失败的关键因素。多药耐药性(MDR)主要由ATP结合盒转运蛋白(ABC转运蛋白)介导，这些蛋白将化疗药物主动运出细胞，减少其细胞毒性。目前，MDR逆转剂主要包括化学药物如维拉帕米(Vera)，但传统中药(TCMs)也显示出一定的MDR逆转潜力。由于TCMs成分复杂，建立一种快速、安全、有效的体外筛选方法至关重要。本研究旨在通过D-荧光素的外排动力学，建立一种简单快速的体外方法来筛选TCMs中的MDR逆转剂。

研究方法

本研究建立了一种基于D-荧光素外排动力学的体外方法，用于筛选传统中药中的多药耐药逆转剂。首先，通过慢病毒转染技术构建了稳定表达荧光素酶的多柔比星耐药细胞系(MCF-7/DOXFluc)。接着，选取多种传统中药成分，利用生物发光成像(BLI)技术检测D-荧光素在MCF-7/DOXFluc细胞中的外排动力学，评估这些中药成分对D-荧光素外排的抑制效果。通过MTT实验测定不同中药成分对MCF-7/DOXFluc细胞的半数抑制浓度(IC50)，并记录D-荧光素的外排曲线，计算外排动力学参数。最后，在MCF-7/DOXFluc肿瘤荷载小鼠中，评估理想逆转剂(如槲皮素，Qu)与多柔比星(DOX)联合使用时的抗肿瘤效果，并通过高效液相色谱(HPLC)测定肿瘤中DOX的分布。

实验结果

图1：展示了实验的整体设计，包括D-荧光素作为ABC转运蛋白底物的使用，以及MCF-7/DOXFluc细胞系的建立和应用。

图2：展示了不同TCMs对MCF-7/DOXFluc细胞D-荧光素外排的影响，包括IC50值的测定和D-荧光素外排曲线的绘制。结果显示，Qu显著增加了D-荧光素的保留。

图3：展示了在MCF-7/DOXFluc肿瘤荷载小鼠中，Qu对D-荧光素外排的影响。BLI信号显示，Qu显著增加了D-荧光素在肿瘤中的保留。

图4：展示了Qu与DOX在不同比例下对MCF-7/DOXFluc细胞的协同抑制效果，确定了最佳的联合比例为2:1。

图5：展示了Qu与DOX联合使用对肿瘤体积、重量和BLI信号的影响，结果显示联合治疗显著抑制了肿瘤生长。

图6：展示了DOX在肿瘤中的分布，以及Qu对DOX保留的影响。结果显示，Qu显著增加了DOX在肿瘤中的保留，从而在低剂量下维持了疗效并减少了毒性。

研究结论

研究结果表明，槲皮素(Qu)显著增加了MCF-7/DOXFluc细胞中D-荧光素的保留，其效果与阳性对照维拉帕米相当。体外和体内实验均显示，Qu显著抑制了D-荧光素的外排，且两者之间具有高度一致性。此外，Qu与DOX联合使用显著抑制了MCF-7/DOXFluc肿瘤的生长，包括肿瘤体积和重量的减少。Qu还增加了DOX在肿瘤中的保留，从而在低剂量下维持了DOX的疗效，并减少了其毒性。综上所述，本研究提供了一种新型、高效、低成本的方法来筛选传统中药中的多药耐药逆转剂，该方法不仅适用于单体化合物，还适用于中药复方制剂。