丙型肝炎病毒（HCV）感染周期特异性微RNA分析揭示阶段特异性miR-4423-3p靶向RIG-I以促进感染

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：Hepatitis C Virus Infection Cycle-Specific MicroRNA Profiling Reveals Stage-Specific miR-4423-3p Targets RIG-I to Facilitate Infection

中文标题：丙型肝炎病毒(HCV)感染周期特异性微RNA分析揭示阶段特异性miR-4423-3p靶向RIG-I以促进感染

发表期刊：《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》

影响因子：6.1

作者单位：

1.Department of Microbiology, Faculty of Naval Medicine, Naval Medical University, Shanghai, China

2.Spine Center, Department of Orthopedics, Shanghai Changzheng Hospital Affiliated to Naval Medical University, Shanghai, China

作者信息：

Xijing Qian,Bingan Wu,Chen Xu

研究背景

丙型肝炎病毒(HCV)感染是全球慢性肝病的主要原因之一，涉及多种病理过程和宿主因素，包括非编码小RNA。尽管已有研究报道了一些与HCV感染相关的基因，但潜在的调控网络尚不明确。本研究通过小RNA测序，明确了HCV感染的Huh7和Huh7.5.1细胞中miRNA的表达谱，鉴定了在HCV生命周期不同阶段表达失调的miRNA，揭示了miRNA在HCV感染和进展中的调控网络，为疾病的新治疗和诊断靶点提供了新的视角。

研究方法

本研究使用Huh7和Huh7.5.1细胞进行HCVcc(JFH-1基因组)感染实验，通过免疫荧光和实时定量PCR检测感染效果。在感染后不同时间点提取总RNA，构建小RNA cDNA文库，并利用Illumina HiSeq™ 2500测序仪进行高通量小RNA测序。同时，通过免疫荧光实验检测HCV核心蛋白，实时定量PCR检测病毒RNA水平。此外，还合成了miR-4423-3p的模拟物和抑制剂，并使用FuGENE HD转染试剂转染细胞，研究其功能。HCV假病毒颗粒(HCVpp)通过HEK 293T细胞生成，用于评估HCV进入效率。最后，通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-4423-3p与RIG-I或IFN-g的3’UTR的相互作用。

实验结果

图1：展示了HCV感染过程中miRNA的表达谱，通过层次聚类分析和主成分分析，揭示了不同感染阶段和不同细胞系之间的miRNA表达差异。

图2：展示了HCV感染的Huh7和Huh7.5.1细胞中miRNA的表达差异，通过Venn图和qPCR验证了38个重叠的miRNA，其中6个miRNA在两个细胞系中表达趋势一致。

图3：展示了HCV感染过程中不同阶段(进入、复制和传播)的miRNA表达变化，揭示了各阶段特异性的miRNA。

图4：展示了Huh7和Huh7.5.1细胞中与RIG-I/IFN途径相关的miRNA，通过miRanda算法预测miR-4423-3p可能与RIG-I或IFN-g mRNA结合。

图5：展示了miR-4423-3p对HCV感染的影响，包括miR-4423-3p模拟物和抑制剂对HCV感染的影响，以及miR-4423-3p对HCV进入、复制和组装的影响。

图6：展示了miR-4423-3p对RIG-I及其下游因子表达的影响，通过RT-qPCR和双荧光素酶报告基因实验验证了miR-4423-3p对RIG-I的调控作用。

研究结论

本研究通过高通量测序分析了HCV感染过程中不同阶段的miRNA表达谱，发现6个miRNA在Huh7和Huh7.5.1细胞中表达趋势一致，32个miRNA在感染过程中表达失调。其中，miR-4423-3p通过直接结合RIG-I mRNA，抑制RIG-I/IFN途径，显著促进HCV感染。miR-4423-3p的过表达增加了HCV核心蛋白和病毒RNA水平，而其抑制则减少了病毒蛋白和RNA水平。此外，miR-4423-3p通过抑制RIG-I及其下游因子(MAVS、TRAF3、TBK1和IRF-3)的表达，抑制了宿主的抗病毒反应。本研究揭示了HCV感染周期中不同阶段特异性的miRNA，为理解HCV感染的分子机制提供了新的见解，并为开发新的诊断和治疗靶点提供了潜在的分子证据。