甘露糖化血清白蛋白纳米颗粒成像监测抗PD-1治疗下的肿瘤相关巨噬细胞

Fluc细胞是经过基因工程改造后能够表达萤火虫荧光素酶的细胞，因其高灵敏度、低背景干扰、蛋白稳定性强和耐热性而在生物医学研究和药物开发中被广泛应用。这些细胞不仅能够用于验证miRNA与mRNA、lncRNA、circRNA之间的相互作用，还能动态监控肿瘤生长和转移，以及研究CAR-T细胞治疗的效果。Fluc细胞的高灵敏度和稳定性减少了对样本的侵入性，保持了细胞或组织的天然状态，而其快速反应和低背景发光特性，预示着在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。随着技术的发展，Fluc细胞的应用将进一步扩展，为疾病研究和治疗提供更多可能性。

基本信息

英文标题：Mannosylated-serum albumin nanoparticle imaging to monitor tumor-associated macrophages under anti-PD1 treatment.

中文标题：甘露糖化血清白蛋白纳米颗粒成像监测抗PD-1治疗下的肿瘤相关巨噬细胞。

发表期刊：《Journal of Nanobiotechnology》

影响因子：10.6

作者单位：

1.Institute of Endemic Disease, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Republic of Korea.

2.Department of Nuclear Medicine, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Republic of Korea.

作者信息：

Gyo Jeong Gu, Hyewon Chung, Ji Yong Park, Ranji Yoo, Hyung‑Jun Im, Hongyoon Choi.

研究背景

免疫检查点抑制剂，例如针对程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的抗体，能够通过重新激活免疫系统来阻止肿瘤生长。然而，仅通过肿瘤大小的变化来确定它们的疗效可能不准确。由于肿瘤微环境(TME)中的免疫细胞，包括巨噬细胞，与对抗PD-1治疗的反应相关，因此使用纳米颗粒对肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)进行成像可以无创地提供TME的免疫富集状态。在此，甘露糖化血清白蛋白(MSA)纳米颗粒被用放射性同位素68Ga标记，以靶向巨噬细胞上的甘露糖受体，根据抗PD-1疗法对TME进行无创监测。

研究方法

在本研究中，作者利用7-10周龄的C57BL/6雌性小鼠建立了B16F10-Luc黑色素瘤和MC38-Luc结直肠腺癌模型，通过腹腔注射抗PD-1抗体进行治疗。研究包括了肿瘤体积测量、免疫组化、流式细胞术和定量PCR分析。此外，作者合成了[68Ga]Ga-MSA用于PET成像，以评估肿瘤微环境中巨噬细胞的活性。数据分析采用GraphPad Prism软件，通过t检验和ANOVA进行统计学评估。

实验结果

图1：[68Ga]Ga-MSA纳米颗粒成像在监测肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞的示意图。

图2：“抗PD-1治疗应答者中CD8+ T细胞频率和活性的增强”。

在接受抗PD-1治疗的应答者中，CD8+ T细胞的频率和活性增加。携带B16F10-Luc肿瘤的小鼠在第10天、第14天和第18天接受了100微克的抗PD-1治疗。在开始抗PD-1治疗后15天获取肿瘤。a图显示了抗PD-1治疗后B16F10-Luc肿瘤携带小鼠(非应答者，n=8;应答者，n=6)的平均肿瘤体积和个体肿瘤体积。b图通过评估肿瘤接种后第18天至第25天之间肿瘤生长的百分比来评估响应(非应答者，n=8;应答者，n=6)。c图显示了抗PD-1治疗后肿瘤的重量(非应答者，n=8;应答者，n=6)。d图展示了通过流式细胞术测定的细胞毒性CD8+ T细胞的频率(以CD45+CD3+CD8+群体为门控)(n=6/组)。e图通过流式细胞术测定了肿瘤浸润性CD8+ T细胞中Granzyme B+和IFNγ+的百分比(n=6/组)。f图展示了非应答者和应答者肿瘤中Cxcl9和Cxcl10 mRNA表达的相对水平(n=6/组)。数据以均值±标准误差(SEM)呈现。使用双尾学生t检验确定统计显著性。数据显示了三个独立实验的结果。*p < 0.05;**p < 0.01;****p < 0.0001。

图3：抗PD-1治疗应答者中肿瘤相关巨噬细胞频率的增加。

在接受抗PD-1治疗的应答者中，肿瘤相关巨噬细胞的频率有所增加。在抗PD-1治疗后第15天，研究比较了非应答者和应答者肿瘤中的CD45+和CD45-细胞百分比(非应答者，n=6;应答者，n=5)。通过流式细胞术测量了肿瘤微环境中主要免疫细胞类型的频率(非应答者，n=6;应答者，n=5)。还测定了非应答者和应答者肿瘤中Ccl2和Ccl5 mRNA的相对表达水平(每组n=3)。数据以均值±标准误差(SEM)呈现。使用双尾学生t检验确定统计显著性，对于多重比较，执行了ANOVA和Tukey的后续测试。数据显示了三个独立实验的结果。*p < 0.05;**p < 0.01;***p < 0.001。

图4：抗PD-1治疗应答者与非应答者中[68Ga]Ga-MSA纳米颗粒成像模式的差异。

本研究探讨了抗PD-1治疗应答者与非应答者中[68Ga]Ga-MSA纳米颗粒的不同成像模式。a图提供了MSA的示意图。b图通过流式细胞术测定了非应答者和应答者肿瘤中CD206+细胞的频率(每组n=4)。c图量化了非应答者和应答者肿瘤组织中CD206免疫组化染色的结果。d图展示了根据抗PD-1治疗反应的B16F10-Luc肿瘤携带小鼠的代表性PET成像概览。冠状全身PET图像下方的面板是肿瘤的裁剪矢状面。e图在抗PD-1治疗后第15天测量了非应答者和应答者肿瘤中的病灶与血池(LBP)比率(非应答者，n=14;应答者，n=10)。f图展示了代表性的流式细胞术点图(左)以及通过流式细胞术确定的MSA+细胞百分比(右)(非应答者，n=9;应答者，n=7)。g图显示了在抗PD-1治疗早期阶段(第15天)通过LBP测量的[68Ga]Ga-MSA摄取与晚期(第24天)肿瘤体积的负相关性(非应答者，n=14;应答者，n=10)。上图的比例尺为1毫米，放大图为300微米。数据以均值±标准误差(SEM)呈现。使用双尾学生t检验确定统计显著性。*p < 0.05;**p < 0.01;***p < 0.001。

图5：抗PD-1治疗后MC38-Luc肿瘤小鼠模型中[68Ga]Ga-MSA纳米颗粒成像模式的差异。

在MC38-Luc肿瘤小鼠模型中，对抗PD-1治疗有反应和无反应的小鼠展现出不同的[68Ga]Ga-MSA纳米颗粒成像模式。这些小鼠在第7天、第10天和第13天接受了100微克的抗PD-1治疗，实验在抗PD-1治疗开始后15天进行。a图显示了接受抗PD-1治疗的小鼠(非应答者，n=5;应答者，n=4)的MC38-Luc肿瘤体积。b图通过流式细胞术测定了非应答者和应答者肿瘤中CD206+细胞的频率(非应答者，n=5;应答者，n=4)。c图提供了对抗PD-1治疗有反应或无反应的MC38-Luc肿瘤小鼠的实验代表性PET成像概览。d图在抗PD-1治疗后第22天测量了非应答者和应答者肿瘤中的病灶与血池(LBP)比率(非应答者，n=5;应答者，n=4)。这些结果来自两个独立实验的相似发现。*p < 0.05;**p < 0.01;***p < 0.001;****p < 0.0001。

图6：肿瘤外植体上清液诱导巨噬细胞功能重塑。

本研究探讨了肿瘤外植体上清液(TES)对巨噬细胞功能重塑的影响。a图提供了实验设计的示意图。b图展示了非应答者和应答者来源的TES处理24小时后，骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)中Cxcl9、Cxcl10、iNos、IL-1β和TNFα mRNA表达的相对水平(每组n=3)。数据显示为均值±标准误差(SEM)，并通过双尾学生t检验确定统计显著性。这些数据代表了在三个独立实验中进行的三次重复实验的结果。*p < 0.05;**p < 0.01。

研究结论

研究结论表明，在B16F10-Luc和MC38-Luc肿瘤小鼠模型中，对抗PD-1治疗有反应的小鼠显示出肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和淋巴细胞比例的增加，且TAMs是肿瘤微环境(TME)中最丰富的免疫细胞群体。通过非侵入性的[68Ga]Ga-MSA正电子发射断层扫描(PET)成像技术，研究者观察到在抗PD-1治疗早期阶段，应答者小鼠的TAMs数量增加。这一发现表明，使用MSA纳米颗粒对TAMs进行非侵入性成像可以反映与抗PD-1反应密切相关的TME中免疫细胞的富集状态，这种方法有潜力用于监测和评估免疫检查点抑制剂的抗肿瘤反应。