一种有效的微米级新抗原肿瘤疫苗GP-新抗原在多种肿瘤模型中诱导出强大的抗肿瘤活性

同源异体小鼠肿瘤模型是免疫肿瘤学(I/O)研究中不可或缺的临床前模型，但它们对免疫检查点抑制剂(ICIs)的反应有限，这可能是由于它们的固有低免疫原性。为了解决这一问题，研究人员通过将鸡卵清蛋白(OVA)这一高度免疫原性的蛋白质表达到同源异体肿瘤细胞中，开发了新的免疫原性同源异体模型。这些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，显示出比它们的亲本细胞系更慢的肿瘤生长速度，这可能是由于免疫介导的排斥反应。更重要的是，这些OVA表达的模型对ICIs，特别是抗PD-1治疗，表现出更高的敏感性，这表明它们在增强T细胞介导的免疫反应方面具有潜力。此外，通过过继T细胞转移实验，研究人员验证了这些模型中存在肿瘤特异性记忆T细胞。这些结果表明，OVA工具细胞不仅增强了对ICIs的反应，而且为临床前免疫治疗评估提供了新的、具有更高免疫原性的同源异体模型，这对于I/O研究具有重要的意义。

基本信息

英文标题：A Potent Micron Neoantigen Tumor Vaccine GP-Neoantigen Induces Robust Antitumor Activity in Multiple Tumor Models.

中文标题：一种有效的微米级新抗原肿瘤疫苗GP-新抗原在多种肿瘤模型中诱导出强大的抗肿瘤活性

发表期刊：《ADVANCED SCIENCE》

影响因子：14.3

作者单位：

1. State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, Tianjin Key Laboratory of Protein Sciences, College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, P. R. China

2. Department of Oncology, The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui, Henan Province 453100, P. R. China

作者信息：Zhe Jing, Shuqing Wang, Keyuan Xu, Qian Tang, Wenjing Li, Wei Zheng, Haobo Shi, Kailing Su, Yanting Liu, Zhangyong Hong.

研究背景

肿瘤特异性新抗原，源自肿瘤基因中的非同义点突变，被认为是引发肿瘤免疫排斥反应的理想靶标。这些新抗原不受中枢免疫耐受的限制，能够激发强烈的免疫反应，同时避免了引发自身免疫疾病的风险。个性化的基于新抗原的肿瘤疫苗已成为癌症免疫治疗的一个关键领域，并在全球范围内进行着众多的临床试验。尽管如此，如何有效诱导机体产生大量针对新抗原的特异性T细胞免疫反应仍是该领域面临的主要技术挑战。目前，主要的免疫策略包括将新抗原的长肽与PolyI:C佐剂结合或采用mRNA疫苗技术，但这些方法的效率有限。为了提高T细胞免疫反应的效率和治疗效果，已经开发了一些基于合成聚合物、脂质体和膜囊泡的颗粒疫苗系统。然而，这些系统制备的疫苗颗粒在大小和表面结构上通常不均匀，且批次间一致性差，这影响了疫苗颗粒免疫性能的评估和临床应用，因为疫苗颗粒的大小和形状对其免疫性能有显著影响。

实验结果

图1：GP-新抗原抗原装载系统的制备与特性分析

(A)GP-新抗原疫苗激活抗肿瘤免疫反应并诱导肿瘤凋亡的示意图。

(B)GP-新抗原抗原装载系统的制备流程图。

(C)通过HPLC监测半胱氨酸-OVA257-264与DBCO-PEG4-马来酰亚胺的反应效率。红线表示不同的标准半胱氨酸-OVA257-264，黑线表示DBCO-PEG4-马来酰亚胺，蓝线表示高纯度产品。

(D)通过HPLC监测DBCO-OVA257-264与GP-N3的偶联效率。黑线表示DBCO-OVA257-264。箭头指示实际的DBCO-OVA257-264，而另一个较小的峰是稍微过量的未反应的半胱氨酸肽。红线表示偶联反应后的上清液。

(E)GP、GP-N3和GP-OVA257-264的扫描电子显微镜和透射电子显微镜图像。

(F,G)分别在制备后(F)或在37°C储存不同时间后(G)通过动态光散射分析GP、GP-N3和GP-OVA257-264的粒径。

H) 共聚焦激光扫描显微镜图像，显示RhoB标记的OVA257-264肽偶联在GP表面的GP颗粒。

图2：GP-OVA257-264颗粒通过APCs的摄取激活和交叉呈递。

(A)共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像显示GP-OVA257-264被骨髓源性树突状细胞(BMDCs)摄取。BMDCs与GP-OVA257-264-RhoB共孵育24小时，细胞核和细胞膜分别用DAPI和FITC标记的CD11c抗体标记。

(B)BMDCs中GP-OVA257-264颗粒的溶酶体定位的CLSM图像。BMDCs与GP-OVA257-264-RhoB共孵育24小时，溶酶体用Lysotracker Green标记。

(C-E)GP-OVA257-264在体内的位置和迁移的活体成像。BALB/c小鼠皮下接种GP-OVA257-264-Cy5或对照组，显示接种小鼠(C)、引流淋巴结(D)的荧光图像，以及与PBS接种小鼠相比，引流淋巴结中Cy5的相对荧光强度(E)在免疫后24、48和72小时的情况。C中的黑色箭头表示注射部位。

(F-H)FACS分析体内APCs的摄取。C57BL/6小鼠在腹股沟区域皮下接种FITC标记的OVA257-264、GP或GP-OVA257-264-FITC，24小时后收集引流淋巴结。通过FACS分析DCs(F)、巨噬细胞(G)和B细胞(H)的摄取比例。PBS和未标记FITC的GPs作为阴性对照。

(I,J)GP-OVA257-264激活BMDCs。BMDCs与GP-OVA257-264和对照组共孵育。通过ELISA检测IL-6和IL-12 p70的释放(I)，并通过FACS检测激活标记物CD80、CD86、CD40、MHC-I和MHC-II的表达(J)。

(K,L)FACS分析BMDCs中OVA257-264肽交叉呈递效率。代表性流式细胞图和定量显示BMDCs中OVA257-264-H-2Kb的频率在2小时(K)。显示BMDCs交叉呈递效率的动态图(L)。数据表示均值±标准误差。通过单向方差分析和Tukey的显著性差异多重比较计算统计显著性。* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001。

图3：OVA肽偶联GP颗粒诱导的细胞和体液免疫反应

(A,B)体外OT-1 TCR转基因CD8+ T细胞增殖被GP-OVA257-264颗粒和对照组刺激。显示体外OT-1增殖实验的示意图(A)和FACS的直方图(B)。(C,D)体内OT-1 TCR转基因CD8+ T细胞增殖被GP-OVA257-264颗粒和对照组刺激。显示体内OT-1增殖实验的示意图(C)和FACS的直方图(D)。(E–I)OVA257-264特异性CD8+ T细胞的增殖和激活。C57BL/6小鼠每14天腹股沟接种两次GP-OVA257-264和对照组。然后，代表性的流式细胞图(E)、OVA257-264特异性CD8+ T细胞的定量频率(F)，以及在第二次免疫后7天通过FACS测量的脾细胞中naïve(G)或中央记忆CD8+ T细胞(H)的频率。接种小鼠的脾细胞被OVA257-264体外再次刺激，通过ELISpot实验检测IFN-γ+ CD8+ T细胞增殖(I)。(J–L)体内OVA特异性CD8+ T细胞溶解实验。显示体内CD8+ T细胞溶解实验的示意图(J)、直方图(K)和细胞溶解比率(L)。(M–O)OVA特异性抗体滴度的ELISA。C57BL/6小鼠腹股沟接种GP-OVA323-339和对照组，第二次、第三次和第四次免疫后第7天采集外周血进行ELISA分析。显示OVA特异性IgG(M)、IgG1(N)和IgG2a(O)的动态抗体滴度。数据表示均值±标准误差。通过单向方差分析和Tukey的显著性差异多重比较计算统计显著性。* p < 0.05, ** p < 0.01, **** p < 0.0001。M–O中的黑色与OVA323-339相比，M,O中的红色与OVA相比。

图4：GP-OVA257-264联合TLR激动剂在EG7·OVA肿瘤模型中的抗肿瘤效果

在预防性模型中，该疫苗能减缓肿瘤生长并维持小鼠体重。在治疗性模型中，与对照组相比，GP-OVA257-264处理的小鼠肿瘤生长得到控制，体重变化较小。此外，GP-OVA257-264与TLR激动剂联合使用在预防和治疗模型中均提高了小鼠的存活率。活体成像显示，GP-OVA257-264与PolyI:C联合使用能增强疫苗颗粒的迁移至引流淋巴结。这些结果表明，GP-OVA257-264是一种有效的抗肿瘤疫苗候选物，尤其在与TLR激动剂联合使用时。

图5：GP-M30在B16F10黑色素瘤模型中诱导了针对B16F10新抗原M30的特异性细胞免疫反应和抗肿瘤活性

(A-C)对M30特异性CD8+ T细胞的IFN-γ+ ELISpot和ELISA检测。C57BL/6小鼠接种M30或与PolyI:C或CpG 2395联合的GP-M30两次。一部分接种小鼠的脾细胞被M30或B16F10细胞体外再次刺激，并用ELISpot检测(A)，另一部分被M30(B)或OVA257-264(C)体外再次刺激，并用ELISA检测。(D-F)在预防性肺转移B16F10黑色素瘤模型中的抗肿瘤活性。预防性肺转移B16F10黑色素瘤模型的示意图(D)，小鼠每14天皮下接种三次。第三次免疫后第7天，小鼠静脉挑战性地接种1×105 B16F10细胞。小鼠在肿瘤挑战后20天被安乐死，展示不同小鼠的肺部图像(E)和B16F10肺转移的数量(F)。(G-J)对(D-F)中接种小鼠脾细胞中T细胞分化的FACS分析。展示T细胞向CD4+ T(G)或CD8+ T(H)细胞分化的比例，以及CD8+ T细胞向TEM(I)或TCM(J)分化的比例。数据表示均值±标准误差。通过单向方差分析和Tukey的显著性差异多重比较计算统计显著性。* p < 0.05, ** p < 0.01。

图6：GP-M25疫苗在4T1乳腺癌模型中激发特异性细胞免疫反应及抗肿瘤效果

(A-C)对M25特异性CD8+ T细胞的IFN-γ+ ELISpot和ELISA检测。BALB/c小鼠接种M25或与CpG 2395联合或不联合的GP-M25两次。一部分接种小鼠的脾细胞被M25体外再次刺激，并用ELISpot检测(A)，另一部分被M25(B)或M35(C)体外再次刺激，并用ELISA检测。(D-F)在预防性4T1模型中的抗肿瘤活性。D) 预防性4T1模型的示意图，小鼠每14天皮下接种三次不同疫苗。在最后一次免疫后第7天，小鼠被挑战性地接种1×105 4T1细胞。肿瘤生长曲线(E)和CD45+肿瘤浸润性淋巴细胞中CD4+/CD8+ T细胞的比例(F)被描绘出来(n=5)。数据表示均值±标准误差。通过单向方差分析和Tukey的显著性差异多重比较计算统计显著性，在(D)中代表与M25相比。p < 0.05, ** p < 0.01。

图7：GP-ME1-ME4在CT26结肠癌模型中诱导了针对CT26新抗原的特异性细胞免疫反应和抗肿瘤激活

(A,B)对ME1/ME4特异性CD8+ T细胞的IFN-γ+ ELISpot和ELISA检测。BALB/c小鼠接种ME1+ME4或与CpG 2395联合或不联合的GP-ME1-ME4两次。接种小鼠的脾细胞被ME1或ME4新抗原体外再次刺激，通过A) ELISpot和B) ELISA检测IFN-γ+ CD8+ T细胞的增殖。(C,D)在预防性CT26模型中的抗肿瘤免疫。预防性CT26模型的示意图(C)，小鼠每14天皮下接种三次，最后一次免疫后7天挑战性地接种1×105 CT26细胞。肿瘤生长曲线(D)被描绘出来(n=5)。(E–H)在治疗性CT26模型中的抗肿瘤免疫。治疗性肿瘤模型的示意图(E)，小鼠首先被接种5×105 CT26细胞，然后在肿瘤接种后第5、8、12天皮下接种三次。整体肿瘤生长曲线(F)、存活和无瘤率(G)以及不同疫苗的肿瘤生长曲线(H)被描绘出来。红色箭头指示接种时间点。数据表示均值±标准误差。通过单向方差分析和Tukey的显著性差异多重比较计算统计显著性，* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001。

研究结论

研究人员成功开发了一种新型基于酵母多糖壳颗粒的肿瘤疫苗系统GP-Neoantigen，该系统能够强效激活机体产生针对多种新抗原肽的特异性CD8+ T细胞免疫反应，有效应用于肿瘤治疗。与合成纳米颗粒系统相比，GP-Neoantigen制备简单、批次稳定，具有均匀的颗粒大小，并且能高度特异性地被抗原呈递细胞(APCs)如DCs和巨噬细胞摄取。在动物模型中，该颗粒系统展现出强大的免疫激活能力，有效抑制了包括EG7·OVA淋巴瘤、B16F10黑色素瘤、4T1乳腺癌和CT26结肠癌在内的多种小鼠同种肿瘤模型中肿瘤的生长。此外，与PolyI:C或CpG 2395佐剂联合使用时，肿瘤抑制效果进一步显著增强。尤为重要的是，这种策略不仅能在多个小鼠模型中实现肿瘤的完全清除，还能在清除肿瘤的小鼠中诱导长期的肿瘤排斥记忆，避免肿瘤再生长。这些研究成果为GP-Neoantigen疫苗系统的临床推广及个性化疫苗接种治疗提供了广阔前景。